Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Los exosomas son pequeñas vesículas que van en tamaño desde 30 nm a 100 nm que se liberan tanto de manera constitutiva y a la estimulación de una variedad de tipos de células. Se encuentran en un número de fluidos biológicos y son conocidos por llevar una variedad de proteínas, lípidos y moléculas de ácido nucleico. Originalmente pensado para ser poco más que depósitos para desechos celulares, los roles de los exosomas que regulan los procesos biológicos y en enfermedades son cada vez más apreciados.
Varios métodos han sido descritos para el aislamiento de exosomas de medios de cultivo celular y los fluidos biológicos. Debido a su pequeño tamaño y baja densidad, ultracentrifugación diferencial y / o ultrafiltración son las técnicas más comúnmente utilizadas para el aislamiento exosome. Sin embargo, el plasma del VIH-1 en individuos infectados contiene tanto exosomas y las partículas virales del VIH, que son similares en tamaño y densidad. Por lo tanto, la separación eficiente de los exosomas de partículas virales de VIH en plasma humano ha sidoun desafío.
Para hacer frente a esta limitación, hemos desarrollado un procedimiento modificado de Cantin et. al., 2008 para la purificación de exosomas de partículas de VIH en el plasma humano. Iodixanol gradientes de velocidad se utilizaron para separar los exosomas del VIH-1 partículas en el plasma de VIH-1 en individuos positivos. Las partículas de virus fueron identificados por ELISA p24. Los exosomas se identificaron sobre la base de marcadores de exosoma de la acetilcolinesterasa (AChE), y los antígenos CD9, CD63, CD45 y. Nuestro procedimiento de gradiente produjo preparaciones exosome libres de partículas de virus. La purificación eficiente de los exosomas del plasma humano nos permitió examinar el contenido de los exosomas derivados de plasma y para investigar su potencial modulador inmune y otras funciones biológicas.
Introduction
El VIH-1 epidemia sigue teniendo un impacto significativo en todo el mundo. A partir de 2013, aproximadamente 35 millones de personas en el mundo vivían con el VIH, y 2,1 millones de ellos eran personas recién infectadas 1. Las estrategias de prevención y un mayor acceso a la terapia antirretroviral han sido de gran ayuda en la reducción de la adquisición global de VIH. Sin embargo, las poblaciones individuales siguen experimentando alzas en la adquisición del VIH 1. Por lo tanto, existe la necesidad de seguir trabajando para hacer frente a esta epidemia.
Uno de los más fuertes predictores de la progresión de la enfermedad del VIH es la activación inmune crónica (CIA) 2-10. Definido por niveles persistentemente elevados de citocinas y marcadores detectables elevada expresión en la superficie de los linfocitos T, la CIA se ha atribuido a: i) la producción de células dendríticas continua de IFN de tipo I 11; (ii) la activación inmune directa impulsado por las proteínas del VIH Tat, Nef y gp120 12; (iii) Translocación de proteínas bacterianas en el intestino asociado células inmunes 6. Sin embargo, el mecanismo exacto (s) crónica subyacente, la activación inmune sistémica en la infección por el VIH aún no se han esclarecido completamente.
Nuestro grupo de investigación y otros han demostrado un papel de exosomas en la patogénesis del VIH de 15-18. Nuestro grupo ha determinado que la proteína Nef se excreta de las células infectadas en exosomas 15 y exosomal Nef (exNef) está presente en el plasma de individuos infectados por el VIH a niveles de nanogramos 18. Hemos demostrado que transeúnte células T CD4 + expuestos a exNef dieron lugar a la activación inducida por la muerte celular dependiente de la vía de CXCR4 19, 20. Alternativamente, los monocitos / macrófagos fueron refractarios a la apoptosis inducida por exNef, pero exhibido funciones celulares alteradas y la expresión de citoquinas. Exosomas Recientemente, nuestro grupo ha demostrado aisladas del plasma de personas infectadas con el VIH contienen una variedad de citoquinas pro-inflamatorias. Further, las células mononucleares de sangre periférica tratados previamente expuestos a exosomas derivados del plasma de pacientes infectados por el VIH inducidas expresión de CD38 en las células de memoria naïve y el centro de T CD4 + y CD8 +. Esto probablemente contribuye a la inflamación sistémica y la propagación viral través de la activación celular espectadora 21, y sugiere que los exosomas juegan un papel importante en la patogénesis del VIH.
Al investigar el papel de los exosomas en la patogénesis del VIH, un desafío está desarrollando técnicas para exosomas eficazmente separados de partículas de VIH manteniendo al mismo tiempo el contenido exosomal así como su capacidad inmunomoduladora funcional. Varios métodos han sido descritos para el aislamiento de exosomas del cultivo de células y fluidos biológicos 22,23. Debido a su pequeño tamaño y baja densidad (exosomas flotan a una densidad de 1,15 – 1,19 g / ml), ultracentrifugación diferencial y / o ultrafiltración son las técnicas más comúnmente utilizadas para el aislamiento exosome 23.Sin embargo, con infección por VIH sobrenadantes de cultivo celular y el plasma de los pacientes contienen tanto exosomas y el VIH-1 partículas virales. Los exosomas y el VIH-1 partículas son muy similares en tamaño y densidad. Alternativamente, aprovechando la expresión de marcadores exosomal únicas, tales como CD63, CD45, CD81 y, exosomas han sido aislados utilizando métodos de captura de inmunoafinidad 23. Este procedimiento puede separar virus de exosomas. Sin embargo, el inconveniente de esta técnica es la unión apretada de anticuerpos frente a los exosomas purificados, lo que podría interferir con la evaluación del potencial inmunomodulador de los exosomas en cultivo.
Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un procedimiento para la purificación de exosomas de partículas de VIH en el plasma humano modificados de Cantin y compañeros de trabajo 22 utilizando gradientes de velocidad Iodixanol. Fueron encontrados exosomas para segregar en el de baja densidad / fracciones superiores del gradiente iodixanol, mientras que las partículas de virus segregados en el altofracciones de densidad / inferiores. Las partículas de virus fueron identificados por ELISA p24 y exosomas se identificaron utilizando marcadores exosome AChE, CD9, CD63, CD45 y. Las fracciones de baja densidad superiores recogidos contenían exosomas que fueron negativas para la contaminación del VIH-1 p24. La purificación eficiente y la separación de exosomas de partículas de VIH en plasma humano permite examen preciso del contenido de exosomas derivados de plasma humano, así como la investigación de su potencial inmunomodulador y el valor diagnóstico y pronóstico de exosomas en el VIH-1 patogénesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
La activación crónica inmune (CIA) y la depleción de células T CD4 + son dos características importantes de la infección VIH-1. Ellos se han establecido como predictores de la patogénesis, con la CIA de ser el mejor predictor. Sin embargo, los mecanismos subyacentes que impulsan la activación inmune sistémica crónica y el deterioro de las células T CD4 + todavía no han sido completamente aclarada. Nosotros y otros laboratorios han desarrollado pruebas firmes de que los exosomas secretadas por el VIH-1 en las…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
Riferimenti
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