Isolement des exosomes dans le plasma du VIH-1 individus positifs
Summary
Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.
Abstract
Les exosomes sont de petites vésicules dont la taille varie de 30 nm à 100 nm qui sont libérés de manière constitutive à la fois lors de la stimulation et à partir d'une variété de types de cellules. On les trouve dans un certain nombre de fluides biologiques et sont connus pour réaliser une variété de protéines, des lipides et des molécules d'acide nucléique. Initialement pensé pour être un peu plus de réservoirs pour les débris cellulaires, les rôles des exosomes régulation des processus biologiques et dans les maladies sont de plus en plus appréciés.
Plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement d'exosomes à partir de milieux de culture cellulaire et des fluides biologiques. En raison de leur petite taille et de faible densité, ultracentrifugation différentielle et / ou ultrafiltration sont les techniques les plus couramment utilisées pour l'isolement du exosomes. Cependant, le plasma de VIH-1 contient à la fois des individus infectés exosomes et des particules virales de VIH, qui sont similaires en taille et en densité. Ainsi, une séparation efficace des exosomes à partir de particules virales de VIH dans le plasma humain a étéun challenge.
Pour remédier à cette limitation, nous avons développé une procédure modifiée de Cantin et. al., 2008 pour la purification des exosomes de particules de VIH dans le plasma humain. Iodixanol gradients de vitesse ont été utilisés pour séparer les exosomes à partir de particules de VIH-1 dans le plasma d'individus HIV-1 positifs. Les particules virales ont été identifiés par ELISA p24. Les exosomes ont été identifiés sur la base des marqueurs d'exosomes acétylcholinestérase (AChE), et les antigènes CD9, CD63, CD45 et. Notre méthode du gradient a abouti à des préparations d'exosomes libres de particules virales. La purification efficace des exosomes de plasma humain nous a permis d'examiner le contenu des exosomes dérivés du plasma et d'étudier leur potentiel modulateur immunitaire et d'autres fonctions biologiques.
Introduction
Le VIH-1 épidémie continue à avoir un impact significatif dans le monde entier. Dès 2013, environ 35 millions de personnes dans le monde vivaient avec le VIH, et 2,1 millions d'entre eux étaient personnes nouvellement infectées 1. Les stratégies de prévention et un accès accru au traitement antirétroviral ont été utiles dans la réduction de l'acquisition globale du VIH. Cependant, les populations individuelles connaissent encore des hausses de l'acquisition du VIH 1. Ainsi, il est nécessaire de poursuivre les efforts pour faire face à cette épidémie.
L'un des meilleurs prédicteurs de la progression de la maladie VIH est l'activation immunitaire chronique (CIA) 2-10. Défini par la persistance de niveaux élevés de cytokines et des marqueurs détectables d'expression élevées à la surface des lymphocytes T, la CIA a été attribué à: i) la production de cellules dendritiques continue d'IFN de type I 11; (ii) l'activation immunitaire directe tirée par les protéines du VIH Tat, Nef et gp120 12; (iii) Translocation des protéines bactériennes dans les cellules immunitaires de l'intestin associée 6. Cependant, le mécanisme exact (s) chronique sous-jacente, l'activation immunitaire systémique dans l'infection à VIH restent à élucider.
Notre groupe de recherche et d'autres ont démontré un rôle des exosomes dans la pathogenèse du VIH 15-18. Notre groupe a déterminé que la protéine Nef est excrété par les cellules infectées dans les exosomes 15 et exosomal Nef (exNef) est présent dans le plasma d'individus infectés par le VIH à des niveaux de l'ordre du nanogramme 18. Nous avons montré que spectateur cellules T CD4 + exposés à exNef ont abouti à la mort cellulaire induite par activation dépendant de la voie CXCR4 19, 20. En variante, des monocytes / macrophages étaient réfractaires à l'apoptose exNef induite, mais exposé fonctions cellulaires altérés et l'expression des cytokines. Exosomes Plus récemment, notre groupe a montré isolés à partir du plasma d'individus infectés par le VIH contiennent une variété de cytokines pro-inflammatoires. Fucomplémen taires, les cellules mononucléaires du sang périphérique naïfs exposés à des exosomes dérivés du plasma de patients infectés par le VIH induit l'expression de CD38 sur les cellules mémoire naïf et centrale CD4 + et CD8 +. Cela contribue probablement à l'inflammation systémique et la propagation virale par l'intermédiaire de l'activation des cellules de voisinage 21, et suggère que les exosomes jouent un rôle important dans la pathogenèse du VIH.
En enquêtant sur le rôle des exosomes dans la pathogenèse du VIH, le défi est de développer des techniques pour séparer efficacement les exosomes de particules de VIH, tout en maintenant le contenu de exosomal ainsi que leur capacité immunitaire fonctionnel modulateur. Plusieurs méthodes ont été décrites pour l'isolement d'exosomes à partir de culture de cellules et fluides biologiques 22,23. En raison de leur petite taille et de faible densité (exosomes flottent à une densité de 1.15 à 1.19 g / ml), ultracentrifugation et / ou ultrafiltration différentielle sont les techniques les plus couramment utilisées pour l'isolement du exosomes 23.Cependant, infectés par le VIH surnageants de culture de cellules et le plasma de patients exosomes contiennent à la fois HIV-1 et des particules virales. Les exosomes et le VIH-1 particules sont très similaires en taille et en densité. En variante, en profitant de l'expression de marqueurs exosomales uniques tels que CD63, CD45, CD81 et, exosomes ont été isolés en utilisant des procédés de capture 23 immunoaffinite. Cette procédure peut séparer le virus de exosomes. Cependant, l'inconvénient de cette technique est la fixation étanche d'anticorps aux exosomes purifiés, qui pourraient interférer avec évaluation du potentiel immunomodulateur des exosomes en culture.
Pour répondre à ces limitations, nous avons développé une procédure pour la purification des exosomes de particules de VIH dans le plasma humain modifiés de Cantin et collègues utilisant 22 iodixanol gradients de vitesse. Les exosomes ont été trouvés à séparer dans la faible densité / fractions supérieures des gradients de iodixanol, tandis que les particules de virus isolés dans la hautedensité / fractions inférieures. Les particules virales ont été identifiées par p24 ELISA et exosomes ont été identifiés en utilisant des marqueurs d'exosomes Ache, CD9, CD63, CD45 et. Les fractions supérieures à faible densité recueillies contenaient exosomes qui étaient négatifs pour la contamination du VIH-1 p24. La purification efficace et la séparation des exosomes à partir de particules de VIH dans le plasma humain permet l'examen précis de la teneur en exosomes issus de plasma humain ainsi que l'étude de leur potentiel de modulateur immunitaire et la valeur diagnostique et pronostique des exosomes dans le VIH-1 pathogenèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'activation chronique immunitaire (CIA) et CD4 + déplétion des cellules T sont deux caractéristiques importantes de l'infection VIH-1. Ils ont été établis comme prédicteurs de la pathogenèse, avec la CIA étant le meilleur prédicteur. Cependant, les mécanismes sous-jacents de l'activation immunitaire systémique chronique et T CD4 + baisse de la cellule ne sont toujours pas complètement élucidé. Nous et d'autres laboratoires ont développé des preuves solides que les exosomes sécrétés p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.
Materials
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
Riferimenti
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