망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석
Summary
The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.
Abstract
Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.
Introduction
글루타메이트는 망막 1에서 주요 흥분성 신경 전달 물질이다. 바이폴라 전지 (2)로부터 글루타메이트 시냅스 입력을 수신하는 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)는, 뇌 영상 정보를 전송 망막의 출력 뉴런이다. 생리 학적 연구는 망막 신경절 세포의 시냅스 여기가 NMDA 수용체 (NMDARs)와 AMPA 수용체 (AMPARs) 3,4,5에 의해 postsynaptically 매개되는 것으로 나타났다. 망막 신경절 세포의 흥분성 시냅스 후 전류 (EPSCs)가 AMPARs 및 NMDARs에 의해 매개되어 있지만 망막 신경절 세포에 3,5,6,7,8, 자연 미니어처 EPSCs (mEPSCs)는 만 AMPARs 매개 구성 요소 4,5,9을 나타낸다. 그러나, 글루타메이트 흡수를 감소시키는 것은 RGC의 수상 돌기에 NMDARs이 흥분성 시냅스의 외부에 위치 될 수 있음을 시사 자발적인 EPSCs 5 NMDAR 구성 요소를 한 것으로 밝혀졌습니다. 막 – 관련 구아닐산 키나제 등 PSD-95 (MAGUKs)이 글루타메이트 수용체 이온 채널을 포함한 클러스터 신경 전달 물질 수용체시냅스 부위에서의도 구별 subsynaptic 10,11,12,13,14 발현 패턴을 나타낸다.
최근 수십 년간, 촛점 면역 사전 매립 전자 현미경 (EM) 면역 위에 막 수용체 발현을 연구하기 위해 사용되었다. 촛점 면역 수용체 발현 넓은 패턴을 보여준다하더라도, 그 해상도가 낮은 것이 불가능 세포 내 위치를 구별하는 데 사용할 수있다. 포유 동물의 망막에 사전 내장 EM 연구는 NMDAR의 서브 유닛이 콘 바이폴라 전지 리본 시냅스 15, 16, 17에서 시냅스 요소 내에 존재 함을 나타냅니다. 이것은 생리 학적 증거 명백 대조적이다. 그러나, 반응 생성물의 확산을 미리 매립 immunoperoxidase 방법에서 공지 된 이슈이다. 따라서,이 방법은 일반적으로 통계적으로 신뢰할 수있는 데이터를 제공하지 않습니다 및 extrasynaptic 막 18,19,20,21 대 시냅스 막에 현지화 사이의 구별을 제외 할 수 있습니다. 에다른 한편으로는, 생리 및 해부학 적 데이터는 망막 신경절 세포 3,5,7,9,22에 AMPARs의 시냅스 현지화과 일치한다. 따라서, 망막 리본 시냅스에서 글루타메이트 수용체와 MAGUKs는 시냅스에뿐만 아니라 perisynaptic 또는 extrasynaptic 막 구획뿐만 아니라 현지화됩니다. 그러나, 망막 리본 시냅스에서 이들의 막 단백질의 고해상도의 정량 분석이 여전히 필요하다.
여기서는 콜레라 독소 소단위 B를 사용하여 라벨 (CTB)를 래트 망막 신경절 세포 상 시냅스에서 이들 단백질의 개수 밀도 변동을 추정 하였다 NMDAR 소단위, AMPAR 소단위와 PSD-95 subsynaptic 현지화를 검사 postembedding EM의 immunogold 기술 개발 역행 추적 방법.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 성공적으로 정량 후 삽입 immunogold에게 EM을 네 가지 기술을 설명했다 : 1) 짧고 약한 고정, 2) 동결 대체, 3) 포스트 포함 immunogold 염색, 4) 정량.
EM의 immunogold는 얇은 조직 섹션에서 특정 단백질의 검출을 할 수 있습니다. 금 입자로 표지 된 항체를 직접 EM을 사용하여 가시화 할 수있다. 막 수용체의 subsynaptic 현지화를 검출하는 강력한 반면, EM의 immunogold 기술적으로 도전, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원의 난청 및 기타 통신 장애의 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소 (NINDS) 및 국립 연구소 (NIDCD), (NIH)의 교내 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 NINDS EM 시설과 지원 NIDCD 고급 이미징 코어 (코드 번호 ZIC DC 000081-03)를 감사합니다.
Materials
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Dilution 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | Dilution 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | Dilution 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | Dilution 1/100 |
| Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles | EMS | 25704 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles | EMS | 25814 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles | EMS | 25812 | Dilution 1/20 |
| Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Dilution 1/20 |
| Formvar-Carbon coated nickel-slot grids. | EMS | FCF2010-Ni | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400-1 | |
| Methanol | EMS | 67-56-1 | |
| Lead citrate | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultromicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| liquid nitrogen | Roberts Oxygen | ||
| Propane | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Dilution 1/4000 |
Riferimenti
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