This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.
This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.
Genel amaç ECIS biyosensör hücre ekim, depolanması ve akışkan bioçipler test edilmesi için bir yöntem geliştirmektir. Bu biyosensör geliştirilmesi için hedef askerler tarafından kullanılan içme suyu kaynaklarının olası kontaminasyonu tespit olabilecek bir alan taşınabilir aygıt için ABD Ordusu özelliklerini karşılamak üzere idi. toksisite sensörü gereksinimleri cihaz alan taşınabilir olması o, insan sağlığı ile ilgili konsantrasyonlarda (bir saat içinde) hızla toksik endüstriyel bileşiklerin geniş bir yelpazede algılayabilir ve biyolojik bileşenlerin bir raf ömrüne sahip olacağını vardı en az dokuz ay. bozulabilen parçalar kabul edilebilir soğutma, ancak, dondurma değil.
Tarihsel olarak, (örneğin, antikorlar, enzimler ya da nükleik asitler gibi) bunların biyolojik bir bileşeniyle alanı içme suyu testi teknolojileri analit özgü 1-3 olmuştur. biyosensörler bu tür dezavantajı onl olmasıdırY aynı anda kimyasal bir tür algılar. birden fazla kimyasal mevcut olduğu şüphesi varsa çoklu sensör ihtiyaç vardır. Belirli bir sensör testi repertuarında değilse, suda kimyasal kirleticiler kolayca algılanmayan gidebiliriz.
Geniş tabanlı toksisite sensörler, diğer taraftan, bu teknoloji boşluğu doldurmak için potansiyele sahiptir. Bunlar genellikle onlara 4-8 bir hücresel bileşeni var. Geniş tabanlı toksisite biyosensörler avantajları, zaman 5,9,10 nispeten kısa bir süre içinde karışımlar ve bilinmeyenler de dahil olmak üzere kimyasal kirleticilerin, geniş bir yelpazeye varlığını tespit edebilen vardır.
Aynı zamanda elektrik hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) olarak da bilinir olası toksisite sensörü, hücre tek katmanlarının elektrik empedansının ölçümü ile konsepti ilk olarak Giaever ve Keese 11 tarafından tarif edilmiştir. Son yirmi yılda hücre viab hassas bir göstergesi olduğu gösterilmiştirility ve sitotoksisite. Temel olarak, bioçipler elektrotlar yapıştırılır hücre tekli-tabakası, yüksek frekanslı ve düşük voltaj ve akımı alternatif akım sinyaline maruz kalmaktadır. hücreler sık tek tabaka elektron akışını engeller. Hücre mono tabakasının bütünlüğünün (örneğin, bir toksik kimyasal ilave edilir olduğu gibi) bozulduğunda ECIS sensörü elektrik empedans değişikliği kaydeder 11-14. Şekil 1 Biochip hücre tek tabaka ile ilgili olarak ECIS ilkesini göstermektedir .
Şekil 1:.. Basitleştirilmiş ECIS okuyucu elektrik şematik bir biochip üzerindeki bir hücre tek tabaka ECIS İllüstrasyon prensibi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tohumlama, depolama ve ihtiva eden akışkan bioçipler test yöntemleriBir ECIS biyosensöründeki akışkan biochipler üzerinde RTgill-W1 hücrelerinin mono tabakaları burada açıklanmaktadır. akışkan biochip bir buzdolabında durumda en fazla 9 ay süreyle saklanabilir ve ayrı ayrı sevk edilir, içme suyu SUPPLIES.THE eşlik ECIS okuyucular, ya da test ünitelerinin test edilmesi için, soğuk bir saklama kabı olarak sevk edilebilir. biochip onlara iki bileşeni vardır; iki ayrı sıvı kanalları ve empedans algılama kanal başına dört elektrot pedleri içeren bir alt elektronik tabaka ile bir üst polikarbonat tabaka. ped başına 10 çalışma elektrotlar vardır; Her bir elektrod çapı 250 mm. monte biochip ECIS test ünitesi takıldığında empedans okumaları elde etmek için altın elektrot bağlantıları var. Iki kapalı akışkan U-şekilli kanalların her biri. RTgill-W1 hücre süspansiyonu 2 ml sahip 2, tek bir algılama elektrodu bir konfluent hücreler büyütme ile ECIS okuyucu bir akışkan Bioçip göstermektedir olacaktır.
<p class= "Fo" "jove_content": keep-together.within-page = "1">ECIS teknolojisi laboratuvar ortamında iyi bir performans ve insan sağlığı ile ilgili olan konsantrasyonlarda potansiyel su kirleticileri tespit etmeyi başardı. Teknolojinin taşınabilirlik ve paketleme alanı kullanımına da elverişli hale getirir.
1) kültür, tohumlama sırasında aseptik koşullarda koruyun ve bioçipler beslenmesi, 2) RTgill-W1 hücreleri beri test için hazır olana kadar buzdolabında koşullarda seribaşı bioçipler tutun aşağıdaki gibidir: teknolojinin başarısı için protokol kritik adımlar çok uzun da 25 ° C nin üzerindeki sıcaklıklara maruz sonra yaşayamaz, 3) doğru bir toz halinde ortam şişeler L-15ex ağırlığında ve doğru bir değişiklik neden olabilir yanlış pozitif üretilmesi önlemek için, su numuneleri ölçmek medya ziyade örnek toksisite osmolalitesi, 4) testleri çalıştırmak için ECIS ekranda kullanıcı yönergeleri izleyin. okuyucu yazılım bi eğer kullanıcıyı uyarırbiyoçip ilk okuyucuya takıldığında ochip (ilk empedans okumaları göre) test için kabul edilemez. empedans düzeyleri test için kabul edilemez ise, yazılım, yeni bir biyoçip kullanılıncaya kadar kullanıcı testi ile devam etmek izin vermez. kabul edilemez empedans okumaları için nedenleri yüzünden ECIS okuyucu pimleri veya Biochip yapıştırma kenarlarından biri boyunca sıvı kaçağı ile biyoçip elektrotlar hafif bir hiza genellikle bulunmaktadır.
ECIS sensör sadece içme suyu ile test ve yüzey suyu ile olmuştur çünkü bu teknoloji için bazı sınırlar vardır. Biochip Hangi RTgill-W1 hücreleri (süre sıcaklığına bağlı olarak saatlerden günlere kadar olabilir, uzun süreli dönemler için daha 25 ° C'nin üzerinde dondurma ya sıcaklıklara uyum olabilir. Biochipler bir sıcaklık aralığı içinde iyi işlev soğutulmuş arasında oda sıcaklığı 7. Onlar hemen r olduktan sonra, ancak, hemen kullanıma hazırsoğuk depodan emoved. Taşınabilir soğuk saklama kapları, şu anda sıcaklığa duyarlı malzemeleri için alanında Ordu personeli tarafından kullanılmaktadır. Bu aynı kaplar numaralı seribaşı biyoçip taşınması için de kullanılabilir.
Bu teknolojinin bir başka sınırlama, bir geniş bantlı toksisite sensörü olsa bile hiç değilse, bu gibi bir böcek ilacı gibi kolinesteraz önleyici bileşikler ile, iyi yanıt olmasıdır. Bu özellik, boşluğu doldurmak için ECIS sensörü toksisite testinin daha geniş bir kullanıcıya sağlamak için su numuneleri test edilirken bir ticari olarak temin edilebilir, hızlı pestisit deney tahlili ile bağlantılı olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kit 30 dakika içinde organofosfat ve karbamat pestisitler algılamak için tasarlanmış hızlı bir enzimatik bir testtir.
Şu anda algılamak için askeri koruyucu hekimlik personel tarafından kullanılan alan su test sistemi, arsen – ECIS sensörü wqas-PM (Önleyici Tıp Su Kalitesi Analiz Sistemi) tamamlarBir içme suyu numunesinde ic, kurşun ya da siyanür. ECIS sensörü kirletici ne tespit olmaz, ancak bazı metaller veya organik bileşikler, bu ise, bu su, insan tüketimi için uygun olmayabilir belirten gösterir. ECIS test sonuçları bir saat içinde mevcuttur. Pozitif test sonucu varsa su numuneleri daha sonra kirletici tanımlanması için daha fazla analiz için gönderilebilir.
Yukarıda tarif edildiği gibi, ECIS okuyucu kirletici saptanması geniş spektrumlu bir kapak için ayrı bir enzimatik ACE kiti içeren bir sistemin bir parçası olarak tasarlanmıştır. Bu okuyucuların her ikisi de askerler tarafından saha kullanımı için alan taşıma için sağlam bir durumda paketlenmiş ediliyor.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.
Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips. |
PBS, w/o Ca++ or Mg++ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
70 % ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
20 mL syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
1 gram silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C. | |
Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells. |
Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip. |
Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip. |
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing. |
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C. |