جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة
Summary
نقدم طريقة لعزل الجهاز الكبار كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة). علينا أيضا أن يبرهن على وجود إجراءات المناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا هذه التقنيات تتيح دراسة خلايا الشعر والخلايا الداعمة، وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في القوقعة.
Abstract
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Introduction
القوقعة على شكل حلزوني في الأذن الداخلية، الواردة في العظم الصدغي، ويوجد في جهاز كورتي، والسمعي الجهاز نهاية الحسي في الثدييات. ويتم تنظيم القوقعة tonotopically وتنقسم عادة إلى قمية، والمتوسطة، والقاعدية يتحول الموافق المناطق ترددية مختلفة مع الكشف عن الصوت عالية التردد في قاعدة وانخفاض الكشف عن التردد في قمة 1. خلايا الشعر، خلايا ميكانيكية حسية من جهاز كورتي، تشغيل طول القوقعة، وهو ما يقرب من 6 مم طويل في الفئران 2،3. هذه الخلايا بتحويل الطاقة الميكانيكية من الموجات الصوتية التي تنتقل عن طريق التيه الغشائي مملوءة بسائل، إلى إشارات العصبية التي تتم معالجتها من قبل هياكل السمعية المركزية. تقنية الموضحة هنا يوفر طريقة لتحضير يتصاعد كاملة من جهاز كورتي بعد تكلس القوقعة كاملة (للعينات تتراوح بين أسبوع واحد من العمر إلى سن البلوغ). كما نقدم طريقة لimmunostaining كلها محمولة على الأنسجة القوقعة. يتصاعد كلها قوقعة حاسمة لرؤية جميع خلايا الشعر والخلايا المحيطة دعم في الترتيبات المكانية الطبيعية وتسمح للتحليل في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر متحد البؤر.
د. هانز انجستروم وهارلو عدس وصف في الأصل كله جبل طريقة تشريح قوقعة الأذن في عام 1966. وهي المفصل تقنية لإصلاح سريع وتشريح قوقعة متكلسة المغمورة في السائل من مجموعة متنوعة من الثدييات، والحفاظ على شرائح سليمة قصيرة من جهاز كورتي عن التحليل المجهري 4. كما تم توضيح وتشريح لغير المثبتة، متكلسة القوقعة الفئران في شريط فيديو تعليمي 5. د. قدمت باربرا Bohne وغاري هاردينغ في جامعة واشنطن عدة تعديلات هامة لهذا الأسلوب. في النسخة الخاصة من طريقة جبل كامل القوقعة، وكان العظم الصدغي decalcified، جزءا لا يتجزأ من البلاستيك، وكانت خمس نصف المنعطفات أو عشرة ربع يتحول dissecتيد 6،7. الدكتور تشارلز ليبرمان وزملاؤه في مختبرات بيبودي إيتون، ماساتشوستس العين والأذن المستوصف، تعديل هذه التقنية لذلك لم يكن مطلوبا أن التضمين البلاستيك 8. حدث مزيد من التعديل للتقنية في مختبر الدكتور جيان تسوه في مستشفى سانت جود للاطفال البحوث 12/09 الذي أبلغ طريقة تشريح المقدمة هنا. نحن نستخدم استراتيجية مختلفة للوصول إلى جهاز كورتي من Bohne وليبرمان، والذي يسمح عزل قمي كاملة، والمتوسطة، والمنعطفات القاعدية. وهكذا فإن تشريح الأنسجة أكبر وأقل عرضة للالمفقودة أو التالفة أثناء عمليات تشريح أو المناعية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة الحالية يسهل قياس المسافة من طرف القمي أو ربط القاعدية لتعريف المنطقة التردد.
على الرغم من أن العديد من المعامل أداء المناعية للأنسجة القوقعة، فمن غير الواضح أين نشأت هذه الطريقة. ونتيجة لذلك هناك وصفات مختلفة لمنع العازلهالتمرير ومخازن الأجسام المضادة الحضانة التي قد تؤثر على أداء الأجسام المضادة الأولية الفردية. هنا، نقدم طريقة واحدة لالمناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently التي تنطبق على الأجسام المضادة الأكثر استخداما في مجال السمعي.
شكل معقد من القوقعة، هيكل الدقيق للجهاز كورتي، وتغطية عظمي توفر تحديا للتحليل النسيجي والبيوكيميائية. وتستخدم مجموعة متنوعة من التقنيات حاليا في مجال السمع للتغلب على هذه الميزات صعبة وتصور الخلايا داخل جهاز كورتي، كل أسلوب مع مزاياه وعيوبه. بروتوكول المعروضة هنا يسمح لكامل تشريح جبل القوقعة الماوس الكبار و، مع تعديل طفيف، يمكن أن يحتمل أن تستخدم لدراسة الهياكل الحيوية داخل قوقعة من مجموعة متنوعة من الكائنات النموذج الأخرى المستخدمة في هذا المجال.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح كامل تشريح جبل والمناعية. ولكن قبل أن يتم إجراء أي من هذه الطرق، هناك حاجة إلى تثبيت السليم للأنسجة القوقعة. نوصي باستخدام الميثانول الحرة، نقي للغاية، EM الصف PFA. PFA مصنوعة من مسحوق يمكن أن يكون لها آثار الميثانول ودرجة الحموضة غ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Materials
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
Riferimenti
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. . Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters’ cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
