De volledige en actuele "Rotifer polycultuur Method" voor het opfokken van First Feeding zebravis
Summary
Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This “polyculture” strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an “on-demand”, nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.
Introduction
De zebravis (Danio rerio) is een vooraanstaande proefdier gebruikt in een groeiend aantal wetenschappelijke disciplines, waaronder maar niet beperkt tot ontwikkelingsstoornissen genetica, toxicologie, gedrag, aquacultuur, regeneratieve biologie, en het modelleren van vele menselijke aandoeningen 1-5. Hoewel de species relatief gemakkelijk in het laboratorium te handhaven, zijn er een aantal managementuitdagingen verband met hun cultuur 6. De meest prominente van deze is opkweek van larven, vooral wanneer de vissen eerst beginnen te voeden na gas blaas inflatie 7. Onder normale gecontroleerde omstandigheden, deze ontwikkelingsfase gebeurtenis bij ~ 5 dagen na de bevruchting (DPF), met de volgende 3 – 5 dagen kweek zijn bijzonder kritisch 7. De centrale technische moeilijkheid in deze fase is om adequaat te voldoen aan de nutritionele behoeften van de eerste voeding larven – feed items moet de juiste maat zijn, Digestible, aantrekkelijk, en beschikbaar op een bijna continue basis, zonder dat overmatige afval kweken tanks. Historisch gezien is dit meestal bereikt door het leveren van een groot aantal kleine hoeveelheden voer om de vis in tanks, samen met routine water uitwisseling 8,9. Hoewel deze methoden zijn tot op zekere hoogte succesvol, ze zijn inefficiënt, vereisen een hoge input van arbeid, en terug te keren enige variabele en beperkte de tarieven van de groei en overleving 10.
In de natuur, de zebravis larven vermoedelijk voeden met overvloedige kleine zoöplankton aanwezig in de waterkolom 11. Daarom larvicultuur protocollen die levend voer zoals Paramecium, raderdiertjes en artemia bevatten typisch efficiëntste 7. In 2010, Best en co-auteurs aangetoond dat het mogelijk was om larvale zebravis groeien statische, brak water met zout raderdiertjes de eerste 5 dagen van exogene voeding 12. Deze aanpak, die harnases de natuurlijke hoge productiviteit van rotifer culturen om een ruime, zeer voedzaam prooi te bieden zonder vervuiling van het water, levert zeer hoge tarieven van larvale groei en overleving met een lage input van arbeid 12,13. De laatste jaren hebben een toenemend aantal laboratoria wereldwijd variaties van dit protocol vastgesteld, en velen nu kweken raderdiertjes op continue wijze om de kweek systemen 14 ondersteunen.
In de afgelopen jaren hebben methoden voor zowel raderdiertje / zebravis polycultuur en raderdiertje productie is verfijnd en verbeterd om meer gestandaardiseerde en gemakkelijk schaalbaar geworden. Dit artikel bevat stap-voor-stap instructies voor het 1) continu en robuust rotifeer productie en 2) de oprichting van de rotifer / zebravis polycultuursysteem gebruikt om de sterke groei van de vis te ondersteunen voor de eerste 5 dagen van exogene voeding.
Protocol
Representative Results
Discussion
Succesvolle implementatie van de rotifer polyculture methode voor het voeden van de vroege larvale zebravis vereist een effectieve protocollen voor twee taken: het opzetten en onderhouden van een continu rotifer kweeksysteem te voeden de vis, en het kweken van de eerste voeden zebravis larven samen met raderdiertjes in dezelfde tank.
De opstelling voor continue zoutwater rotifer productiesysteem voor zebravis laboratoria eerst beschreven door Lawrence en co-auteurs 14 is gewijzigd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De zorg en het gebruik van vis gegenereerd voor representatieve resultaten beschreven in dit protocol werd uitgevoerd in volledige overeenstemming met de uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite in Boston Children's Hospital, het protocol # 14-05-2673R richtlijnen.
Materials
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 Liter Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
Riferimenti
- Ribas, L., & Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., & Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics : TIG. 29, 611-20 (2013).
- Santoriello, C., & Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., & Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., & Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). CRC Press (2010).
- Nusslein-Volhard, C., & Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. Oxford University Press (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press (2007).
- Carvalho, P., & Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., & Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., & Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3) 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., & Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-6 (2012).
- Tucker, C. S., & Hargreaves, J. A. Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 634-657 (2004).
