Die vollständige und aktualisierte "Rädertier Polyculture-Methode" für die Aufzucht Erste Fütterung Zebrafisch
Summary
Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This “polyculture” strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an “on-demand”, nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.
Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein herausragender Labortier in einer wachsenden Zahl von wissenschaftlichen Disziplinen verwendet, einschließlich, aber nicht Entwicklungsgenetik, Toxikologie, Verhalten, Aquakultur, Regenerationsbiologie und der Modellierung von vielen menschlichen Erkrankungen 1 begrenzt – 5. Obwohl die Spezies ist relativ einfach im Labor zu erhalten, gibt es eine Anzahl von Management-Herausforderungen mit ihrer Kultur 6 verbunden. Der prominenteste von ihnen ist Larvenaufzucht, vor allem, wenn der Fisch zuerst beginnen zu füttern im Anschluss an Gasblase Inflation 7. Unter normalen, kontrollierten Bedingungen erfolgt diese Entwicklungs Ereignis bei ~ 5 Tage nach der Befruchtung (DPF), mit den folgenden 3-5 Tagen Wachstum besonders kritisch 7. Die zentrale technische Schwierigkeit in dieser Phase ist es, die ernährungsphysiologischen Anforderungen der ersten Fütterung Larven adäquat zu begegnen – Futterteile müssen von geeigneter Größe sein, Digesvereinbar, attraktiv, und auf einem nahezu kontinuierlichen Basis, ohne dass übermäßige Abfälle in Kultivierungstanks. Historisch gesehen hat sich in der Regel durch die Bereitstellung von zahlreichen kleinen Futtermengen, um die Fische in Tanks, zusammen mit Routine Wasseraustausch 8,9 erreicht. Während diese Methoden sind zu einem gewissen Grad erfolgreich, sind sie ineffizient, erfordern einen hohen Arbeitseinsatz, und kehren nur variabel und begrenzten Wachstumsraten und Überlebensrate 10.
In der Natur, Zebrafisch-Larven ernähren sich vermutlich in der Wassersäule 11 reichlich kleines Geschenk Zooplankton. Aus diesem Grund larviculture Protokolle, die Live-Feeds, wie Paramecium, Rädertierchen und Artemia übernehmen in der Regel die effizienteste 7. Im Jahr 2010, Top und Co-Autoren gezeigt, dass es möglich war, Larven Zebrafisch in statischen, Brackwasser sowie Salzwasserrädertierchen für die ersten 5 Tage exogene Fütterung 12 wachsen. Dieser Ansatz, der nutzbares die natürliche hohe Produktivität der Rädertierchen Kulturen zu reichlich, sehr nahrhaft Beute belasten das Wasser nicht zu schaffen, die Renditen sehr hohe Larven Wachstum und Überleben mit niedrigen Arbeitseinsatz 12,13. In den letzten Jahren haben immer mehr Labors auf der ganzen Welt Variationen dieses Protokoll anzuwenden sind, und viele jetzt Kultivierung Rädertierchen in einer kontinuierlichen Weise in den Kindergarten-Systeme 14 zu unterstützen.
In den vergangenen Jahren wurden Methoden für die beiden Rädertierchen / Zebrafisch polyculture und Rädertierchen Produktion verfeinert und verbessert, um mehr standardisiert und leicht skalierbar sein. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für 1) stetig und robust Rädertierchen Produktion und 2) die Einrichtung der Rädertierchen / Zebrafisch Polykultursystems verwendet werden, um ein robustes Wachstum der Fische für die ersten 5 Tage von exogenen Zuführung zu unterstützen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erfolgreiche Umsetzung der Rädertierchen polyculture Verfahren zum Zuführen frühen Larvenzebrafisch erfordert effektive Protokolle für zwei Aufgaben: die Schaffung und Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Rädertierchen Kultursystem, um die Fische zu füttern und das Züchten der ersten Fütterung Zebrafisch-Larven zusammen mit Rädertierchen in der gleichen Tank.
Die Einrichtung für eine kontinuierliche salz rotifer Produktionssystem für Laboratorien Zebrafisch zuerst von Lawrence…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Pflege und Nutzung von Fischen in diesem Protokoll beschriebenen repräsentativen Ergebnisse generated in voller Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Boston Kinderkrankenhaus, Protokoll # 14-05-2673R festgelegten Leitlinien durchgeführt.
Materials
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 Liter Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/h (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
Riferimenti
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. . The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish, A Practical Approach. , (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. . Biology and Culture of Channel Catfish. 34, 634-657 (2004).
