हम बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन में अमीर सेल व्युत्पन्न matrices प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, macromolecular crowders (एमएमसी) का उपयोग। इसके अलावा, हम एक प्रोटोकॉल जो 3 डी organotypic त्वचा सह संस्कृति पीढ़ी है, जो संस्कृति के समय को कम कर देता है, जबकि निर्माण की परिपक्वता को बनाए रखने में एमएमसी को शामिल किया गया प्रस्तुत करते हैं।
कोलेजन के ग्लाइकोप्रोटीन परिवार मानव शरीर में मुख्य संरचनात्मक प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है, और आधुनिक ऊतक इंजीनियरिंग में इस्तेमाल किया biomaterials के प्रमुख घटक हैं। के रूप में यह बेहद धीमी है, संयोजी ऊतक और बाद में ऊतक सामंजस्य की उप इष्टतम गठन में जिसके परिणामस्वरूप, विशेष रूप से त्वचा मॉडल में एक तकनीकी अड़चन, इन विट्रो में कोलेजन के बयान है। यहाँ, हम एक विधि है जो त्वचा संस्कृतियों के लिए विभिन्न आकार सुक्रोज सह पॉलिमर के अलावा शामिल macromolecular भीड़ (एमएमसी), जो कोलेजन बयान का एक नाटकीय वृद्धि में परिणाम उत्पन्न करने का वर्णन है। विशेष रूप से, त्वचीय fibroblasts नियंत्रण करने के लिए की तुलना में एमएमसी के तहत कोलेजन मैं / चतुर्थ / सातवीं और fibronectin की एक महत्वपूर्ण राशि जमा किया।
प्रोटोकॉल भी एक विधि का वर्णन भीड़ सेल परतों decellularize करने के लिए है, जो संस्कृति सतह पर बनाए रखा गया बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के महत्वपूर्ण मात्रा को प्रकाश में लाने के रूप में immunocy इसका सबूतtochemistry। कुल मैट्रिक्स द्रव्यमान और वितरण पैटर्न हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अध्ययन किया गया था। रचना और आकृति विज्ञान बदलती के दिलचस्प है, fibroblasts, केरेटिनकोशिकाओं और सह संस्कृतियों का उत्पादन सेल व्युत्पन्न matrices (सीडीएम)। सीडीएम इस प्रकार अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक अनुप्रयोगों की दिशा में बढ़ रहा है, के रूप में माध्यमिक सेल बोने, जहां कोटिंग्स या scaffolds के वर्तमान उपयोग, आम तौर पर xenogenic पशु स्रोतों से बचा जा सकता है के लिए "जैव scaffolds 'का इस्तेमाल किया जा सकता है।
इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल एक 3 डी organotypic त्वचा सह संस्कृति मॉडल है जो, Dermo-एपिडर्मल जंक्शन (DEJ) में ईसीएम बयान को बढ़ाने के लिए विशेष रूप से पर्याप्त था, कोलेजन सातवीं, प्रमुख घटक के जलमग्न चरण के दौरान एमएमसी के आवेदन का वर्णन के तंतुओं प्रस्तोता। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एमएमसी के साथ विकसित संस्कृतियों में तंतुओं प्रस्तोता नियंत्रण की तुलना के रूप में की उपस्थिति की पुष्टि की। प्रस्तोता तंतुओं एपिडर्मिस को डर्मिस तार के रूप में यह महत्वपूर्ण है, इसलिए,एक पूर्व गठित परिपक्व DEJ भ्रष्टाचार स्थिरता और कुल मिलाकर घाव भरने के मामले में त्वचा भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं लाभ हो सकता है खा रहे हैं। इसके अलावा, संस्कृति समय 3 सप्ताह के लिए 5 हफ्तों से सघन था एक परिपक्व निर्माण प्राप्त करने के लिए, जब एमएमसी का उपयोग कर, लागत को कम करने।
त्वचा पानी की कमी और रोगज़नक़ प्रवेश को रोकने के द्वारा एक सुरक्षात्मक बाधा रूपों। यह तीन प्रमुख घटकों से बना है; stromal अमीर डर्मिस 1, एक स्तरीकृत एपिडर्मिस 2,3,4 यह की चोटी पर, और 5,6 के बीच में Dermo-एपिडर्मल जंक्शन। डर्मिस कोलेजन और लोचदार फाइबर का काफी हद तक बना है और कम fibroblasts 7 के साथ आबादी है। इसके विपरीत, सेल अमीर एपिडर्मिस केरेटिनकोशिकाओं की कई परतों से बना है। भीतरी सबसे परत के केरेटिनकोशिकाओं proliferative हैं और नए बेसल कोशिकाओं जो नवीनीकृत और टर्मिनली फर्क केरेटिनकोशिकाओं कि लगातार त्वचा की बाहरी परत-सबसे करने के लिए कदम और उनके नाभिक और cytoplasmic सामग्री खो दिया है, एक श्रृंगित परत है जो होकर गुजरती है, जिसके परिणामस्वरूप की जगह प्रदान करते हैं विशल्कन।
त्वचीय-एपिडर्मल जंक्शन, तहखाने झिल्ली का एक विशिष्ट प्रकार, एक जटिल परस्पर मैट्रिक्स अणु है, जो tethe की रचना की संरचना हैडर्मिस को एपिडर्मिस रु। कोलेजन मैं डर्मिस के तंतुओं कोलेजन तंतुओं सातवीं जो कोलेजन चतुर्थ अमीर पटल Densa के लिए लंगर डाले हैं प्रस्तोता के साथ जिल्द। एंकरिंग तंतु (laminin 5, कोलेजन XVII और इंटेग्रिन) बदले में बेसल keratinocytes के hemidesmosomes साथ पटल Densa कनेक्ट। बेसल keratinocytes (परत basale) पैदा करना और नवीनीकृत करने के लिए, के रूप में अच्छी तरह से अलग और suprabasal परतों के लिए फार्म विभक्त के रूप में की क्षमता है; परत spinosum, परत granulosum, और अंत में परत corneum, जो पर्यावरण के साथ त्वचा के संपर्क सतह का प्रतिनिधित्व करता है। श्रृंगित परत करने के लिए बेसल परत से एन मार्ग, केरेटिनकोशिकाओं cytokeratins की अभिव्यक्ति पैटर्न स्विच और अंत में apoptosis से गुजरना और श्रृंगित में खुद को डिब्बे में बंद लिफाफे, विशिष्ट प्रोटीन है कि covalently transglutaminase गतिविधि के द्वारा crosslinked कर रहे हैं के hulls।
त्वचा और इन विट्रो में इसकी परतों पुनः, की जटिल संरचना सहित त्वचीय-एपिडर्मल जंक्शन और चमड़े का बाह्य मैट्रिक्स, और cornification प्रक्रिया का अनुकरण करने के लिए, लंबे समय से intrigued वैज्ञानिकों और एक चुनौतीपूर्ण कार्य के रूप में bioengineers है। , रोगी बायोप्सी से त्वचा कोशिकाओं के सफल निकासी और रोगी व्युत्पन्न त्वचा कोशिकाओं 8 का उपयोग त्वचा organotypic संस्कृतियों की पीढ़ी वहाँ त्वचा ऊतक इंजीनियरिंग में उल्लेखनीय प्रगति की है, उदाहरण के लिए किया गया है। हालांकि, अनसुलझी समस्याओं को खुद त्वचा कोशिकाओं द्वारा बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का स्राव गरीब से संबंधित और उप इष्टतम त्वचा मॉडल में जिसके परिणामस्वरूप रहते हैं। इसके अलावा, समय 3 डी organotypic त्वचा सह संस्कृति मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग उत्पन्न करने के लिए आवश्यक चार से आठ सप्ताह के बीच होती है, एक समय सीमा है जो संभावित macromolecular crowders के समावेश के साथ छोटा हो सकता है। संस्कृति के समय को कम करना, अभिकर्मक लागत की बचत होती है सेल वार्धक्य की घटनाओं को कम कर देता है और रोगी के समय के इंतजार के उत्पाद क्लिनिक में इस्तेमाल किया जाना चाहिए कम कर देता है।
टी "> Macromolecular भीड़ (एमएमसी) संस्कृति के माध्यम से विशिष्ट अणुओं को शुरू बाहर रखा मात्रा प्रभाव। ये procollagen के proteolytic दरार जो मानक जलीय संस्कृति की स्थिति 9-13 के तहत मंदा है सहित enzymatic प्रतिक्रिया दरों को प्रभावित। एमएमसी के तहत, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने के लिए शामिल अभिकर्मकों 14,15 में जिसके परिणामस्वरूप की मात्रा बढ़ रही uncrowded नियंत्रण 10 की तुलना में procollagen दरार, कोलेजन मैं भीड़ संस्कृतियों में अणुओं की वृद्धि हुई राशि के मामले में, बिना तेजी रहे हैं। कोलेजन को procollagen के रूपांतरण के रूप में कोलेजन के गठन की अनुमति देता है विधानसभाओं, fibroblasts 48 घंटे के लिए एमएमसी के साथ सुसंस्कृत रूप से चार सप्ताह 11,16,17 के लिए नजर रखी uncrowded fibroblast संस्कृतियों की तुलना में काफी अधिक कोलेजन झुकेंगे रहा। enzymatic गतिविधियों है कि गठन, स्थिरीकरण और ईसीएम के पुनर्गठन को प्रभावित, एमएमसी भी पर प्रभाव के अलावा सीधे बढ़ाने और कोलेजन मिलाना दिखाया गया हैफाइबर गठन 18,19।हम यहाँ एक तरीका मौजूद है त्वचा कोशिकाओं द्वारा बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) उत्पादन, विशेष रूप से, त्वचीय fibroblasts और एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं में बढ़ाने के लिए। इसके अलावा, हम बताते हैं कि समृद्ध ईसीएम monolayer संस्कृतियों में एमएमसी के तहत उत्पादित decellularized और शुद्ध सेल व्युत्पन्न मैट्रिक्स (सीडीएम) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
हम एक गैर-परंपरागत दृष्टिकोण का उपयोग कल्पना करने के लिए और पूरी तरह से ईसीएम एमएमसी के साथ सुसंस्कृत त्वचा कोशिकाओं द्वारा जमा की सराहना करते हैं। हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी आमतौर पर सेल मैट्रिक्स बातचीत या सेल करने वाली कांच संपर्क अंक के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तकनीक मैट्रिक्स की कुल राशि कांच की सतह पर जमा देखने के लिए हमारी प्रणाली में उपयोग किया गया था। हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी उपस्थिति और एमएमसी के अभाव में फ्लोरोसेंट immunostaining के साथ मिलकर किया गया था बाह्य मैट्रिक्स संरचना और पैटर्न के संदर्भ में जानकारी की सबसे अधिक राशि प्राप्त करने के लिए।
Organotypiसी त्वचा सह संस्कृतियों एक शास्त्रीय विधि से एक तीन आयामी संदर्भ में इन विट्रो में त्वचा मॉडल है। दो आयामी सह संस्कृतियों में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध करा सकता है, यह जब इस डेटा का अनुवाद है और इसे वापस एक विवो वातावरण है, जो स्वाभाविक एक तीन आयामी संरचना है को लागू करने के लिए सीमित है। त्वचा keratinocytes, विशेष रूप से, ध्रुवीकृत कर रहे हैं और शिखर और बेसल वर्ग जो homeostasis और सेल पालन के लिए आवश्यक होते हैं। इसके अलावा, इस तरह के केरातिन 1, केरातिन 10 और filaggrin के रूप में बेसल परत के ऊपर केरेटिनकोशिकाओं में ठेठ suprabasal प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्तरीकरण और keratinocytes के टर्मिनल भेदभाव के पाठ्यक्रम में ही मौजूद है। टर्मिनल भेदभाव ठेठ monolayer संस्कृतियों में शायद ही मौजूद है, suprabasal प्रोटीन अभिव्यक्ति सामान्य रूप से इस संस्कृति प्रणाली में हासिल नहीं है। इसलिए, organotypic संस्कृतियों संस्कृति के माध्यम में डूबे हुए शुरू है, लेकिन उसके बाद keratinocyt ड्राइव करने के लिए एक हवा तरल इंटरफेस करने के लिए उठा रहे हैंई भेदभाव। यह स्तरीकरण मार्कर, यहां तक कि cornification और एपिडर्मल शरीर क्रिया विज्ञान के एक आम तौर पर बेहतर प्रतिबिंब की अभिव्यक्ति में यह परिणाम है। जबकि अन्य समूहों के पहले सफलतापूर्वक organotypic त्वचा सह संस्कृतियों उत्पन्न किया है, एक कार्यात्मक Dermo-एपिडर्मल जंक्शन क्षेत्र की स्थापना एक मुद्दा रहा है। यहाँ, हम एक बढ़ाया तहखाने झिल्ली के साथ organotypic त्वचा सह संस्कृतियों संवर्धन, एक संक्षिप्त समय सीमा में करने के लिए और इन निर्माणों की परिपक्वता से समझौता किए बिना एक नया तरीका मौजूद है। यह इन विट्रो मॉडलिंग के लिए त्वचा mimetics, त्वचा जीव विज्ञान के अध्ययन और स्क्रीनिंग परीक्षणों की एक वर्गीकरण प्रदान करेगा।
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
Primary antibodies | |||
Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
Stratification media | |||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |