פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
על מנת ללמוד את המסלולים המולקולריים של מחלת פרקינסון (PD) ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, חוקרים מדעיים להסתמך על מודלים של בעלי חיים. זיהוי של גנים הקשורים PD הוביל פיתוח מודלים PD גנטי. רוב הדגמים עכבר מהונדס α-SYN לפתח פתולוגיה הדרגתית α-SYN אך אינם מצליחים להציג הפסד התא דופאמין ברור וגירעונות התנהגותי תלויים דופמין. המשוכה הזאת נתקפה טיווח ישיר של nigra substantia עם וקטורים ויראליים overexpressing גנים הקשורים PD. למסירת גן מקומית באמצעות וקטורים ויראליים מספקת דרך אטרקטיבית להביע transgenes במערכת העצבים המרכזית. איזורים מסוימים במוח יכולים להיות ממוקדים (למשל nigra substantia), ביטוי יכול להיגרם בסביבה המבוגרת ורמות ביטוי גבוהות יכולות להיות מושגת. יתר על כן, מערכות וקטור שונות המבוססות על וירוסים שונים ניתן להשתמש. הפרוטוקול מתאר את כל שלבים המכריעים לבצע וקטור ויראליזריקת nigra substantia של החולדה לפתח מודל חית אלפא-synuclein מבוסס וקטור ויראלי לטיפול במחלת הפרקינסון.
Introduction
כדי לחקור את פתופיזיולוגיה של PD ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות, יש צורך דחוף במודלים של בעלי החיים כי דומה בנוירופתולוגיה, סימפטומי פיזיולוגית מנוע של PD אדם. את הערך המנבא הגבוה יותר, כך ניטיב יכול לתרגם טיפולים חדשים מ במודלים של בעלי חיים לחולים.
הגילוי-synuclein אלפא (α-SYN) כמו גן PARK לראשונה ב -1997 הוביל לפיתוח של מודלי PD הגנטיים הראשונים. עכברים מהונדסים רבים overexpressing wild-type אדם (WT) או מוטציה (A30P, A53T) α-SYN נוצרו בעשור האחרון. רמות ביטוי יתר α-SYN הוכיחו להיות מכריע בהתפתחות של הפתולוגיה. גם זן העכבר, קיומו או אי קיומו של אנדוגני α-SYN והאם באורך מלא או בגרסה מקוצרת מתבטא, ממלא תפקיד (סקירה מפורטת על ידי מגן Chesselet 1). התבטאות יתר של שניהם WT וכמה מוטציות קליניות של אדם &# 945; -SYN בעכברים טרנסגניים גורם הצטברות פתולוגית של α-SYN וחוסר תפקוד עצבי 2-6. עם זאת, עד במודלים של עכברים α-SYN עכשיו המהונדסים ביותר לא הצליחו להציג פסד תא דופאמין ברור וגירעונות התנהגותי תלוי דופמין.
המשוכה הזאת נתקפה טיווח ישיר של nigra substantia (SN) עם וקטורים ויראליים overexpressing α-SYN. וקטורים ויראליים נגזרים וירוסים שיכולים להדביק תאים בקלות, מציגים את החומר גנטי לתוך הגנום המארח שלהם ולהכריח את התא המארח לשכפל את הגנום הנגיפי על מנת לייצר חלקיקי נגיף חדשים. וירוסים יכולים להיות מהונדסים שאינם משכפלים וקטורים ויראליים כי לשמור על יכולתם לחדור לתאים ולהציג גנים. על ידי מחיקת חלקים של הגנום הויראלי והחליף על ידי הגנים של עניין, יישום של הווקטור יגרום זיהום סיבוב בודד ללא שכפול בתוך התא המארח, המיועד בדרך כלל כמו 'תמרה'. ג וקטורים ויראלייםלשמש ביטוי יתר שניהם להשתקת גנים. את הגן הביע יכול להיות חלבון כתב (חלבון פלואורסצנטי ירוק למשל או בלוציפראז גחלילית) 7, חלבון טיפולי עבור יישומי ריפוי גנטי 8-10 או, כפי נתמקד במאמר זה, חלבון הקשור למחלות המשמש מודלי מחלה 11 -14.
למסירה גן וקטור בתיווך ויראלי מספק דרך חלופית להביע transgenes של מערכת העצבים המרכזית עם מספר יתרונות. באמצעות משלוח transgene מקומי, איזורים מסוימים במוח יכולים להיות ממוקדים. יתר על כן, ביטוי transgene יכול להיגרם במהלך הבגרות בהפחתת הסיכון מנגנוני פיצוי במהלך הפיתוח. כמו כן, ניתן ליצור מודלי מיני זנים שונים. ולבסוף, transgenes השונה ניתן לשלב בקלות. באמצעות וקטורים ויראליים, רמות ביטוי transgene גבוהה יכולה להיות מושגת, אשר עשוי להיות חיוני מאז תחילת וחומרת המחלה תלויה לעתים קרובות על רמת overexpression.
מערכות וקטור כמה מבוססות על וירוסים שונים פותחו. הבחירה של מערכת הווקטור תלוי בגודל של הגן של עניין, את משך הזמן הנדרש של ביטוי גנים, תא המטרה ובעיות בטיחות ביולוגית. עבור העברת גנים יציבה במוח, lentiviral (LV) ו ויראלי adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) וקטורים נחשבים כיום מערכות וקטור בחירה שכן הם להוביל ביטוי גנים יעיל לטווח ארוך במוח המכרסם. עבור מיקוד ספציפי של נוירונים דופאמינרגיים (DN) של SN, וקטורי rAAV יש outcompeted וקטורי LV בהדרגה בגלל טיטר ויעילות התמרה הגבוהה שלהם של DN.
המודלים המכרסמים הכי הטובים מבוסס α-SYN הזמינים כרגע פותחו מתוך גישה משולבת באמצעות קפסיד AAV החדש (1 rAAV, 5, 6, 7, 8) ו אופטימיזציה בונה וקטור, טיטר, וטוהר 15,16. כייל וקטור וכן טוהר וקטור משפיע ישירותהתוצאה פנוטיפי של המודל. titers וקטור מוגזמת או קבוצות וקטור מטוהרים מספיק עלול לגרום לרעילות הלא ספציפית. לכן, וקטורי בקרה נאותים הכרחיים. השקעת זמן ניכרת בייצור, upscaling וקטור ויראלי, ואת הליכי הטיהור גם הוכיחה חיונית להשיג יצוות וקטור איכות לשחזור גבוה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. כייל וקטור וכן טוהר וקטור השפיע באופן ישיר על התוצאה פנוטיפי של המודל. titers וקטור מוגזמת או קבוצות וקטור מטוהרים מספיק עלול לגרום לרעילות הלא ספציפית. לכן, השימוש של אצוות וקטור באיכות גבוהה וקטורי בקרה נאותים הוא הכרחי. יתר על כ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים יוריס ון Asselberghs ואן ואן Santvoort לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלהם. המחקר מומן על ידי IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80,020), את Vlaanderen FWO (G.0768.10), על ידי תוכנית EC-FP6 "דימי" (LSHB-CT-2005-512,146), את MEFOPA פרויקט FP7 RTD (HEALTH -2,009-241,791), התוכנית FP7 'INMiND' (HEALTH-F2-2011-278850), לובן KU (צה"ל-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), ואת MJFox קרן (אימות יעד 2010). א ואן דר Perren ו Casteels ג הם עמיתים הבתר של הקרן הפלמי של מחקר מדעי. ק ואן Laere הוא עמית קליני בכיר של הקרן הפלמי של מחקר מדעי.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
Riferimenti
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson’s disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson’s disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson’s disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson’s disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson’s Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson’s disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle?. Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
