Ontwikkeling van een Alpha-synucleïne Based ratmodel van de ziekte van Parkinson via stereotactische injectie van een recombinant adeno-geassocieerde virale vector
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
Om de moleculaire wegen van de ziekte van Parkinson (PD) onderzoeken en om nieuwe therapeutische strategieën, wetenschappelijke onderzoekers afhankelijk diermodellen. De identificatie van PD-geassocieerde genen heeft geleid tot de ontwikkeling van genetische PD modellen. De meeste transgene α-SYN muismodellen te ontwikkelen geleidelijke α-SYN pathologie, maar niet om duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven. Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra met virale vectoren overexpressie-PD-geassocieerde genen. Lokale genafgifte via virale vectoren verschaft een aantrekkelijke manier om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie. Specifieke hersengebieden kan worden getarget (bijvoorbeeld de substantia nigra) kan expressie worden geïnduceerd in het volwassen omgeving en hoge expressieniveaus kunnen worden bereikt. Verder kunnen verschillende vector op basis van verschillende virussen worden gebruikt. Het protocol beschrijft alle cruciale stappen om een virale vector uit te voereninjectie in de substantia nigra van de rat een virale vector gebaseerde alpha-synuclein diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.
Introduction
Om de pathofysiologie van PD te bestuderen en om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is er een dringende behoefte aan diermodellen die sterk lijken op de neuropathologie, fysiologie en motorische symptomen van de menselijke PD. Hoe hoger de voorspellende waarde, hoe beter we nieuwe therapieën van diermodellen vertalen naar patiënten.
De ontdekking van alfa-synucleïne (α-SYN) als eerste PARK gen 1997 geleid tot de ontwikkeling van de eerste genetische PD modellen. Veel transgene muizen overexpressie menselijk wild-type (WT) of mutant (A30P, A53T) α-SYN zijn gegenereerd in het afgelopen decennium. De niveaus van α-SYN overexpressie hebben bewezen cruciaal in de ontwikkeling van de pathologie zijn. Ook de muizenstam, de aanwezigheid of afwezigheid van endogene α-SYN en of de volledige lengte of een afgeknotte vorm wordt uitgedrukt, speelt een rol (gedetailleerd overzicht van Magen en Chesselet 1). Overexpressie van zowel WT en verscheidene klinische mutanten van humaan &# 945; -SYN in transgene muizen leidt tot pathologische accumulatie van α-SYN en neuronale dysfunctie 2-6. Echter, tot nu toe de meeste transgene α-SYN muismodellen geen duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven.
Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra (SN) met virale vectoren overexpressie α-SYN. Virale vectoren zijn afgeleid van virussen die gemakkelijk cellen kunnen infecteren, genetisch materiaal in hun gastheergenoom en dwingen de gastheercel het virale genoom repliceren om nieuwe virusdeeltjes produceren. Virussen kunnen worden gemanipuleerd om niet-replicerende virale vectoren op hun vermogen om in cellen en genen te introduceren behouden. Door schrapping delen van het virale genoom en te vervangen door de genen van belang, zal de toepassing van de vector tot een enkele ronde infectie zonder replicatie in de gastheercel, algemeen aangeduid als "transductie". Virale vectoren ceen worden gebruikt voor overexpressie en silencing. De expressie transgen kan een reporter proteïne (bv groen fluorescerend eiwit of vuurvlieg luciferase) 7, een therapeutisch eiwit voor gentherapie toepassingen of 8-10, zoals we zullen zich in dit papier, een ziekte gerelateerd eiwit dat voor ziektemodel 11 -14.
Virale vector gemedieerde genafgifte verschaft een alternatieve manier om transgenen in het CNS tot expressie met een aantal voordelen. Met behulp van lokale transgene levering kunnen specifieke hersengebieden worden gericht. Verder kunnen transgene expressie worden geïnduceerd tijdens de volwassenheid minder kans op compensatiemechanismen tijdens de ontwikkeling. Ook kunnen modellen worden gemaakt in verschillende soorten en rassen. En ten slotte, verschillende transgenen kan gemakkelijk gecombineerd worden. Gebruik virale vectoren, kunnen hoge transgenexpressie niveaus worden bereikt, die cruciaal zou kunnen zijn aangezien het begin van de ziekte en de ernst vaak afhangen van de mate van OVEREXPression.
Verschillende vectorsystemen basis van verschillende virussen ontwikkeld. De keuze van de vector is afhankelijk van de grootte van het gen van belang, de gewenste duur van de genexpressie, de doelcel en bioveiligheidsimplicaties. Voor stabiele genoverdracht in de hersenen, lentivirale (LV) en recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) vectoren worden nu beschouwd als de vectorsystemen gekozen aangezien ze de efficiënte en langdurige genexpressie in de hersenen van knaagdieren. Voor specifieke targeting van de dopaminerge neuronen (DN) van de SN, hebben rAAV vectoren geleidelijk weggeconcurreerd LV vectoren vanwege hun hogere titers en transductie efficiëntie van DN.
De beste α-SYN gebaseerde knaagdiermodellen momenteel beschikbaar zijn ontwikkeld vanuit een gecombineerde benadering, waarbij nieuwere AAV serotypes (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) en geoptimaliseerde vector constructen titers en zuiverheid 15,16. De vector titer evenals de vector zuiverheid directe invloedde fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom passende controlevectoren onontbeerlijk. Geruime tijd investeringen in de virale vector productie, opschaling en procedures zuivering hebben ook bewezen dat het essentieel om reproduceerbare en hoge kwaliteit vector batches te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. De vector titer als de vector zuiverheid rechtstreeks welke fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom is het gebruik van hoge kwaliteit vector series en geschikt controlevectoren onontbeerlijk. Verder is de exacte positionering van het hoofd van de rat in het stereotactische frame en de nauwkeurige bepaling van de coördinaten essentieel is gericht op de s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Joris Van Asselberghs en Ann Van Santvoort voor hun uitstekende technische bijstand. Onderzoek werd gefinancierd door het IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80.020), het FWO Vlaanderen (G.0768.10), van het EG-FP6 programma 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), het KP7 OTO-project MEFOPA (GEZONDHEID -2.009-241.791), het KP7-programma 'Inmind' (HEALTH-F2-2011-278850), de KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), en de MJFox Foundation (Target validatie 2010). A. Van der Perren en C. Casteels zijn een postdoctorale bursalen van het Vlaams Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek. K. Van Laere is senior klinisch fellow van het Vlaams Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
Riferimenti
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson’s disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson’s disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson’s disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson’s disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson’s Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson’s disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle?. Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
