Utveckling av en Alpha-synuklein Based råttmodell för Parkinsons sjukdom via stereotaktisk injektion av en rekombinant adeno-associerad viral vektor
Summary
This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson’s disease.
Abstract
För att studera de molekylära vägar vid Parkinsons sjukdom (PD) och att utveckla nya behandlingsstrategier, vetenskapliga utredare lita på djurmodeller. Identifieringen av PD associerade gener har lett till utvecklingen av genetiska PD-modeller. Mest transgena modeller α-SYN mus utvecklar gradvis α-SYN patologi men misslyckas med att visa klart dopaminerga cellförlust och dopaminberoende beteendestörningar. Detta hinder övervanns genom direkt inriktning på substantia nigra med virala vektorer som överuttrycker PD associerade gener. Lokal genöverföring med hjälp av virala vektorer ger ett attraktivt sätt att uttrycka transgener i det centrala nervsystemet. Specifika delar av hjärnan kan riktas (t.ex. substantia nigra), kan expression induceras i den vuxna inställningen och kan uppnås höga expressionsnivåer. Vidare kan olika vektorsystem baserade på olika virus användas. Protokollet beskriver alla viktiga steg för att utföra en virusvektorinjektion i substantia nigra hos råtta att utveckla en viral vektorbaserad alfa-synuklein djurmodell för Parkinsons sjukdom.
Introduction
För att studera patofysiologin av PD och att utveckla nya behandlingsstrategier, det finns ett brådskande behov av djurmodeller som nära liknar de neuropatologi, fysiologi och motoriska symtom av human PD. Ju högre det prediktiva värdet, desto bättre kan vi översätta nya terapier från djurmodeller till patienter.
Upptäckten av alfa-synuklein (α-SYN) som den första PARK genen i 1997 ledde till utvecklingen av de första genetiska PD-modeller. Många transgena möss som överuttrycker human vild-typ (WT) eller mutant (A30P, A53T) α-SYN har genererats under det senaste decenniet. Nivåerna av α-SYN överuttryck har visat sig vara avgörande för utvecklingen av patologi. Också musstam, närvaro eller frånvaro av endogen α-SYN och huruvida hela längden eller en stympad form uttrycks, spelar en roll (detaljerad genomgång av Magen och Chesselet 1). Överuttryck av både WT och flera kliniska mutanter av humant &# 945; -SYN i transgena möss inducerar patologisk ackumulering av α-SYN och neuronal dysfunktion 2-6. Men fram tills nu mest transgena modeller α-SYN mus misslyckats med att visa klart dopaminerga cellförlust och dopaminberoende beteendestörningar.
Detta hinder övervanns genom direkt inriktning på substantia nigra (SN) med virala vektorer som överuttrycker α-SYN. Virala vektorer är härledda från virus som lätt kan infektera celler, införa genetiskt material i deras värdgenomet och tvinga värdcellen att replikera det virala genomet för att producera nya viruspartiklar. Virus kan vara konstruerad för att icke-replikerande virala vektorer som bibehåller sin förmåga att komma in i celler och införa gener. Genom att ta bort delar av det virala genomet och ersätta dem genom de gener av intresse, kommer tillämpningen av vektorn resulterar i en enda runda infektionen utan replikation i värdcellen, som allmänt betecknas som "transduktion". Virala vektorer cen kan användas för både uttryck och geners uttryck. Den uttryckta transgen kan vara en reporter protein (t.ex. grönt fluorescerande protein eller eldflugeluciferas) 7, ett terapeutiskt protein för genterapitillämpningar 8-10 eller, som vi kommer att fokusera på i detta dokument, en sjukdomsrelaterad protein som används för sjukdom modellering 11 -14.
Viral vektor-medierad gentillförsel tillhandahåller ett alternativt sätt att uttrycka transgener i CNS med flera fördelar. Med hjälp av lokala transgen leverans, kan specifika områden i hjärnan riktas. Vidare kan transgenexpression induceras under vuxenlivet minskar risken för kompensationsmekanismer under utveckling. Dessutom kan modellerna skapas i olika arter och stammar. Och slutligen, olika transgenerna kan enkelt kombineras. Med hjälp av virala vektorer, kan höga transgenexpression nivåer uppnås, vilket kan vara avgörande eftersom sjukdomen bryter ut och svårighetsgrad ofta beror på graden av OVEREXPression.
Flera vektorsystem baserade på olika virus har utvecklats. Valet av vektorsystem beror på storleken av genen av intresse, den erforderliga varaktigheten av genuttryck, målcellen och biosäkerhetsaspekter. För stabil genöverföring i hjärnan, lentivirala (LV) och rekombinant adeno-associerad viral är (rAAV) -vektorer nu anses de vektorsystem av val eftersom de leder till en effektiv och långsiktig genuttryckning i gnagare hjärnan. För specifik inriktning av dopaminerga neuroner (DN) av SN har rAAV-vektorer successivt konkurreras LV vektorer på grund av deras högre titer och transduktion effektivitet DN.
De bästa α-syn baserad gnagarmodeller för närvarande tillgängliga har utvecklats från ett kombinerat tillvägagångssätt med hjälp av nyare AAV serotyper (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) och optimerad vektorkonstruktioner, titer och renhet 15,16. Vektorn titer samt vektor renhet direkt påverkarden fenotypiska resultatet av modellen. Överdriven vektor titer eller otillräckligt renade vektor partier kan resultera i icke-specifik toxicitet. Därför lämpliga styr vektorer är oumbärliga. Avsevärd tid investering i virusvektorproduktion, uppskalning och reningsprocedurer har också visat sig vara nödvändig för att erhålla reproducerbara och högkvalitativa vektor partier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera viktiga steg i protokollet. Vektorn titer samt vektorn renhet påverkar direkt den fenotypiska resultatet av modellen. Överdriven vektor titer eller otillräckligt renade vektor partier kan resultera i icke-specifik toxicitet. Därför är nödvändig att använda högkvalitativa vektor partier och lämpliga kontroll vektorer. Vidare är väsentligt att rikta substantia nigra den exakta positioneringen av råttans huvud i stereotaxisk ram och noggrann bestämning av koordinaterna. Efter borrning av hål…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Joris Van Asselberghs och Ann Van Santvoort för deras utmärkta teknisk assistans. Forskningen har finansierats av IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), den FWO Vlaanderen (G.0768.10), av EG-FP6 programmet Dimi "(LSHB-CT-2005 till 512.146), FP7 FoTU-projekt MEFOPA (HÄLSA -2.009-241.791), FP7 programmet InMind "(HEALTH-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), och MJFox Foundation (Target validering 2010). A. Van der Perren och C. Casteels är en forskarassistenter i den flamländska fonden för vetenskaplig forskning. K. Van Laere är en erfaren klinisk kamrat av den flamländska fonden för vetenskaplig forskning.
Materials
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
Riferimenti
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson’s disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson’s disease in mice. Lancet Neurol. 10, 1108-1118 (2011).
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson’s disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson’s disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson’s disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson’s Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson’s disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson’s disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L. Neurobiology of flies and mice. Science. 288, 631-632 (2000).
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle?. Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
