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Introduction
量子点(QDs)是 半导体时与光1照射表现出荧光性质的纳米晶体。由于它们的小尺寸(2-5纳米),其类似于许多较大的生物分子,和易于biofunctionalization的,量子点是用于生物医学应用的非常有吸引力的工具。他们已经发现在生物标记的使用,单分子的活细胞成像,药物递送, 体内成像 ,病原体检测,和细胞的跟踪,许多其他用途2-8之间。
基于CD的量子点已经在生物医学领域最常用的,因为他们强烈的荧光,窄的发射峰宽9。然而,关注已经提出,由于镉的潜在毒性2+离子 10可通过纳米颗粒的降解被释放。近年来,基于InP基量子点已探索作为一种替代基于镉量子点,因为他们认为许多荧光特性的镉量子点的基础和可能更生物相容性11。基于CD的量子点已被发现比在浓度低至10 分在体外试验基于InP基量子点更毒显著,只有48小时11后。
量子点的荧光发射颜色是尺寸可调的1。也就是说,随着量子点尺寸的增加,荧光发射是红移。量子点的产品的大小和尺寸分散度可以通过在反应12期间改变温度,反应持续时间,或前体浓度的条件进行修改。虽然磷化铟量子点的发射峰通常是更广泛,比基于镉量子点不太激烈,磷化铟量子点可以在种类繁多的设计,以避免光谱重叠的颜色进行,并且是大多数生物医学应用12足够强。在本协议中详述的合成产生与600纳米为中心的红色发射峰量子点。
几个步骤采取自动对焦在QD核之三合成,保持量子点的光学完整性,使其成为生物应用程序兼容。 QD核的表面必须防止可能导致淬火氧化或表面缺陷;因此,一的ZnS壳涂覆在核心产生的InP /硫化锌(核/壳)量子点13。这种涂层已显示保护QD产物的光致发光。锌离子中的InP量子点的合成的存在已经显示出,以限制表面缺陷,以及减少尺寸分布12。甚至用Zn 2+在反应介质存在下,InZnP的合成是非常不可能12。涂布后,所得的InP / ZnS量子点被涂覆在疏水性配体诸如三辛基氧化膦(TOPO)或油胺12,14。两亲聚合物可以与量子点表面上的疏水性配位体以及本体水分子相互作用以赋予水溶性15。与鸬鹚两亲聚合物xylate化学基团可以被用作“化学柄”,进一步官能化的量子点。
该协议细节的合成和水溶性的InP / ZnS量子点的官能具有非常强烈的荧光发射和相对小的尺寸的分散性。这些量子点都可能比常用的CdSe / ZnS量子点毒性较低。在这里,磷化铟/ ZnS量子点的合成提供了基于光盘的量子点生物医学领域的实用替代。
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Protocol
1.磷化铟/硫化锌(磷化铟/硫化锌)量子点的合成
- 磷化铟(InP)量子点核心的合成
- 适合的100ml圆底三颈烧瓶中在12英寸的冷凝器。加30毫升油胺(OLA),0.398克铟(III),氯化(包括3),0.245克锌(II)氯化物( 氯化锌 )并搅拌,同时用真空1小时在室温下抽空。该溶液应出现无色白色沉淀。
- 用加热罩有热电偶和比例 - 积分 - 微分(PID)温度控制器,增加溶液的温度升高到120℃。抽空真空下将溶液进行20分钟,以除去可能影响核心增长低沸点的杂质。
注意:虽然可以使用沙浴和温度计,用加热罩和PID增加反应产物的均匀性和再现性。 - 在惰性气体下(例如N 2),回流溶液,提高温度至220℃15分钟。的INCL 3和 氯化锌完全溶解,得到浅黄色溶液。使温度稳定10分钟。
- 清除一次性,将3ml塑料注射器和4英寸,22克针氮气。使用注射器,快速交付0.5毫升三(二甲氨基)膦(TDMAP)将包括3溶液 。溶液温度略有下降,并返回到220℃。从透明的解决方案的变化,淡黄色至不透明,黑色。
- 9.5分钟后,从加热套除去反应烧瓶,直到温度降低到低于200℃。为了保护在InP核心的完整性,在步骤1.2.1直接进入硫化锌涂层。
- 硫化锌(硫化锌)量子点壳的合成
- 放置在加热罩步骤1.1.5反应瓶中,稳定的Temperature在200℃。慢慢地在15秒的过程中添加3.58克十二硫醇(DDT)含有磷化铟量子点的解决方案。使该溶液1小时反应。
注意:硫化锌壳厚度可通过增加或减少在步骤1.2.4添加的硬脂酸锌的量而变化。改变在步骤1.1.1和1.2.1的ZnCl 2的量或十二硫醇可以通过改变反应动力学显著影响量子点的质量。- 之后,取出从加热套的反应烧瓶中,并使溶液冷却至约60℃。
- 一旦在InP /硫化锌溶液达到〜60℃,加入10 mL己烷和的大约45毫升整个溶液转移至50ml聚丙烯离心管中。离心样品(3,000×g离心10分钟)以除去未反应的固体前体。
- 小心将上清转移到250毫升聚丙烯离心瓶中,加入200毫升丙酮,并离心溶液(3,000×克10分钟),沉淀的InP / ZnS量子点。这个体积也可以被均匀地分为四个50ml试管离心如果必要的转子/附件离心机不可用。倒出上清液并以氮气彻底干燥QD沉淀以除去丙酮。
- 重悬采用超声在20毫升OLA的量子点,转移到50毫升圆底三颈瓶中含有0.474克硬脂酸锌,搅拌。疏散在室温20分钟在真空下该溶液中。
- 在氮气下,将温度升至180℃,并允许反应进行3小时。虽然没有显着的视觉变化在该反应过程中发生的反应溶液,加入硬脂酸锌增加的ZnS壳的厚度,从而通过改善量子点12的表面钝化增加QY。一旦反应完成后,从加热套除去烧瓶并允许该溶液冷却至约60℃。
- 一旦磷化铟/硫化锌soluti上达到〜60℃,添加20毫升己烷和转移至50ml聚丙烯离心管中。离心样品(3,000×g离心10分钟),以除去未反应的硬脂酸锌。
- 小心将上清转移到250毫升聚丙烯离心瓶中,加入200毫升丙酮,并离心溶液(3,000×g离心10分钟)以沉淀的InP / ZnS量子点。小心倒出上清液并以氮气彻底干燥以除去丙酮。
- 溶解在30毫升正己烷在InP / QD硫化锌颗粒。涡旋和超声处理的溶液简短地,以确保完全分散。
- 重复纯化步骤1.2.6-1.2.8两次以确保彻底除去过量的有机配体的。两亲聚合物,并且在步骤1.2量子点之间的相互作用可以在过量的配位体的存在下受到损害。
- 随着等 [16]谢详细的计算,确定使用紫外-可见光谱法合成的InP / ZnS量子点的大小和浓度。
- 放置在加热罩步骤1.1.5反应瓶中,稳定的Temperature在200℃。慢慢地在15秒的过程中添加3.58克十二硫醇(DDT)含有磷化铟量子点的解决方案。使该溶液1小时反应。
2.水使用的两亲聚合物的InP /硫化锌量子点的增溶
- 水增溶
- 从步骤1.2.10使用的InP / ZnS量子点,淡化量子点的一部分用己烷,得到1毫升1μM的量子点。
- 在离心管中,转移0.25毫升的InP / ZnS量子点到每个管中。加入1毫升丙酮或甲醇至离心管中并离心分离(3000×g离心10分钟)。小心取出上清,在1毫升四氢呋喃(THF)溶解沉淀的每个。
- 转移溶解在THF中的InP / ZnS量子点的100毫升圆底烧瓶中,并以16毫升THF稀释。为了减少溶液中的聚集体的数量,超声处理的量子点5-10分钟。
- 在10ml分子级水溶解30毫克聚(马来andhydride- 中高音 -1-十八碳烯),3-(二甲基氨基)-1-丙胺(PMAL-d)中。水浴超声处理或温和搅拌直至溶液是半透明的足以完全溶解聚合物。该使用涡或剧烈搅拌可产生许多气泡,阻碍与QD聚合物的相互作用。 10毫升聚合物溶液加入100毫升圆底含有的InP / ZnS量子点在THF圆底烧瓶中。
- 从使用旋转蒸发器对QD /聚合物溶液蒸发THF中。放置烧瓶在冰浴中,同时蒸发,以促进聚合物和QD之间的相互作用。根据真空的强度,最THF中的10分钟后蒸发,溶液出现混浊。
- 一旦溶液被蒸发至10ml,从旋转蒸发器除去该烧瓶,并添加30毫升分子级的水。烧瓶返回到旋转蒸发器,并继续蒸发至2ml。这最后蒸发步骤可能需要许多小时;确保冰浴被保持。
- 从用吸管圆底烧瓶中除去水溶性的InP / ZnS量子点。使用连接到0.1微米尼龙SY 3毫升的塑料注射器过滤QD溶液RINGE过滤到5ml的离心管中。
- 将量子点到20000 MWCO膜透析机和透析反对的0.05M硼酸盐缓冲液pH 8.5,去除多余的聚合物。 (缓慢加入0.05M的四硼酸钠十水合物,以0.05M的硼酸,在剧烈搅拌下,直到pH为8.5,使这个硼酸盐缓冲溶液。)用真空浓缩,浓缩物中的硼酸盐缓冲的量子点到1ml。
- 用于存储,用Parafilm密封前吹扫用氮气将溶液。水溶性的InP / ZnS量子点是稳定的,在4℃下在黑暗中在至少4个月。
- 从步骤1.2.10使用的InP / ZnS量子点,淡化量子点的一部分用己烷,得到1毫升1μM的量子点。
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Representative Results
未涂层的InP核心不要被眼睛表现出实质性的可见荧光。然而,磷化铟/硫化锌(核/壳)量子点似乎是由眼睛的紫外线照射下明亮荧光。使用荧光光谱的InP / ZnS量子点的荧光的特点。量子点的在己烷中的荧光光谱在533激发(图1)处展示在600nm与半最大值(FWHM)的73纳米的全宽为中心的一个主要的峰。 而在图1的偏移吸光度(0.2)可能意味着量子点的散射光,因此,凝集量子点的存在,闪烁分析( 见下文)表明,大多数的量子点是单一的,或非常小的群体,量子点。与两亲聚合物PMAL-D涂布后,磷化铟/ ZnS量子点的量子产率通过用若丹明B的量子点的积分荧光强度作为标准17进行比较研究。在己烷中量子点的量子产率为determined是平均7.96%(2次测量,7.69%和8.22%),并在水中6.03%的平均(2次测量,5.98%和6.08%)。
同时使用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)的水溶性的InP / ZnS量子点的大小是其特征。 TEM图像,其中仅可视化的表面上的纳米晶体核心和壳(磷化铟/硫化锌),而不是有机配体,在150,000X的标称放大率被抓获。使用ImageJ的斐济18图像进行分析和调整的门槛给二进制图像。最小和最大的Feret直径,平均以确定这些水溶性量子点的直径。这个数据证明了小的,相对单分散量子点与2.74±0.72纳米( 图2A和B)的平均直径。在pH为7的水的量子点,封装在PMAL-d的有效流体动力学直径,由用DLS测定。它应该是注意到,通过DLS有效流体动力学直径测量溶剂化QD,包含QD的表面上的有机配体和聚合物,以及与它们交互的水分子。因此,DLS测定法通常比在TEM实验获得的测量大得多。在该测量中,假定量子点为球形和总共30个测量被捕获,通过使用BIC部分解软件体积计算有效直径。这些值的平均值,从而提供14.8±6.0纳米( 图2C)的平均直径。
为了确定是否合成的InP / ZnS量子点是适合于单分子成像,使用荧光显微镜8进行分析闪烁。而这是不可能通过光学显微镜中,“上”的分析,看个别量子点和“关”的荧光发射状态可以用于鉴定小号英格尔量子点泪小点的荧光图像。代表一个闪烁的量子点泪点一个展品,是从“关闭”状态分化“开”的状态。闪烁量子点的电影(在去离子水稀释至约100pM的)是使用63X,1.4的NA,油浸物镜装到一个落射荧光显微镜用适当的滤波器立方体和CCD照相机捕获。图像进行30毫秒的曝光连续500帧拍摄。通过分析在使用ImageJ 19(图3A)的每个帧的单个泪点(约4个像素)的平均强度进行闪烁分析。在“开”和我们的量子点“关闭”状态之间的差距明显的表示他们对单分子成像( 图3B)的潜力。
在InP / ZnS量子点与细胞的相互作用也通过两个毒性和细胞内在影响。对于使用了这两项研究,小鼠神经母细胞瘤(N2a细胞)细胞和所有实验在(补充有10%胎牛血清和抗生素/抗霉菌50/50的D-MEM / OPTI-MEM)蜂窝介质中进行。一台盼蓝毒性检测20是通过将细胞的N2a 24和48小时用不同浓度的量子点进行。结果证明的N2a细胞可忽略毒性在1-5纳米(图4)之间的QD的浓度。观察QD内化,的N2a细胞用水溶性的InP / ZnS量子点孵育既5和10nM 12小时。这些量子点温育细胞的图像出现后12小时(图5),这是与纳米粒子21的其他内化结果一致证明量子点的溶酶体定位。
图1.吸光度和荧光特性的InP / ZnS量子点,吸收并在533处激发己烷的InP /硫化锌校正的荧光发射光谱,显示出在600nm的最大吸收和73的FWHM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 聚合物涂层的InP / ZnS量子点水大小分析(一)透射电子溶解于水的InP / ZnS量子点的显微照片(比例尺= 50纳米)。透射电镜(B)的粒度分布的直方图结果为2.74±0.72纳米的平均直径。 (C)在水中的InP / ZnS量子点的动态光散射分析,显示14.8±6.0纳米的平均流体动力学直径。large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3 的InP / ZnS量子点的闪烁分析。单荧光泪点的分析,详细说明独特的“上”的存在和“关”通过(A)的InP / ZnS量子点的水使用460纳米±25 nm激发过滤器的闪烁轮廓规定,500纳米长通发射滤光片,和475 nm的分色镜,和(B)直方图从一个QD闪烁的轮廓呈现像素强度的双峰分布。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5的InP / ZnS量子点的内化的N2a细胞荧光显微照片显示的InP / ZnS量子点的内化后0纳米控制(A)DIC(B)QD,和(C)覆盖培养12小时后,12小时5纳米量子点(D)DIC(E)QD和(孵化(G),DIC(H)QD, 和 (I)覆盖培养12小时。比例尺= 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
该协议细节,可以在许多生物体系中使用高度荧光的InP / ZnS量子点的合成。此处所合成的量子点的产品表现出在600nm与FWHM为73nm(图1),这与其他先前描述合成12为中心的单个荧光发射峰。反应时间和反应温度是由于对QD合成质量和可重复性其深远的影响非常重要的步骤。在水中溶解后,量子点都确定为具有约6%的量子产率。反应时间,温度,或前体浓度的变化允许QD的尺寸和发射波长,其可以在多光谱应用中使用的调谐。
大小和表面电荷是在生物系统中使用的纳米粒子时,需要考虑非常重要的因素。为了尽量减少目标生物分子干扰,量子点应该保持一个小的,星期一odisperse大小。此外,在溶液中的表面电荷量子点可以被修改,以减少非特异性朝意外目标结合。这里提出量子点的合成产生量子点与通过TEM的直径为2.74±0.72纳米(只有核心和壳是可见的)( 图2A和2B)。被发现的水溶性量子点以具有14.8±6.0纳米,这与目前用于生物学研究22基于镉量子点的有效流体动力学直径。水性量子点的表面上的电荷和功能可以通过两亲聚合物的羧酸化学基团进一步反应进行修改。
闪烁分析来探索这些的InP / ZnS构成的单分子成像研究的适合性。因为这是不可能通过光学显微镜可视化个别量子点,从个人量子点的闪烁可以被用来识别单个粒子。这个闪烁现象是离散&之间的交替#34;开“和”关“的荧光状态23,这可以使用单个荧光QD泪点的平均像素强度随着时间的推移进行调查的InP /硫化锌QD泪点的荧光痕迹演示特性。”开“和”关“状态( 图3A)。此外,还有在“开”和单个泪点(图3B),这在以前的研究中使用来区分单个颗粒8的“关”状态之间没有重叠。
进一步的实验来研究这些的InP / ZnS量子点用于蜂窝研究的适合性。执行了台盼蓝毒性检测评估的InP / ZnS量子点的生物相容性。培养24小时至在QD浓度范围从1-5纳米,观察到可忽略的毒性(图4),这与对的InP / ZnS量子点11的毒性研究48小时后。实质性毒性,没有观察到贝尔嗷嗷25纳米;此浓度比所需的许多生物医学应用中的高得多。例如,单分子成像研究通常需要对QD探针的PM浓度来标记表面结合的细胞受体24的代表号。此外,在5 10nM或10nM的用于蜂窝媒体12小时与量子点孵育的N2a细胞表明量子点是通过细胞内吞作用内在化, 即,量子点证明细胞内的点状染色模式(图5)。这些结果表明,这些的InP / ZnS量子点的调查细胞过程的适用性。
该协议的细节合成和水溶性的InP / ZnS量子点具有强烈的荧光,规模比较小,分散性和生物兼容性的功能化。这些量子点产品的高质量由单量子点在荧光显微镜可视化,这表明它们适合于单molecul指示Ë成像。可以预期,这些无Cd量子点是潜在于所研究的生物系统,以及研究人员研究它们少得多的毒性。这样,对于生物医学应用中的用途,这些在基于量子点的是稳健的替代基于镉量子点。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者非常感谢化学系和研究生院在密苏里州立大学的鼎力支持这个项目。我们也承认在弗雷德里克国家癌症研究实验室的电子显微镜实验室使用其透射电子显微镜和碳包覆电网。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Oleylamine | Acros | 129540010 | |
Zinc(II) chloride | Sigma | 030-003-00-2 | |
Indium(III) chloride | Chem-Impex | 24560 | |
Tris(dimethylamino)phosphine | Encompass | 50-901-10500 | |
1-dodecanethiol | Acros | 117625000 | |
Hexanes | Fisher Sci | H292-4 | |
Acetone | TransChemical | UN 1090 | |
Zinc Stearate | Aldrich Chem | 307564-1KG | |
Tetrahydrofuran | Acros | 34845-0010 | |
Molecular Water | Fisher Sci | BP2470-1 | |
Poly(maleic anhyrdride-alt-1-tetradecene), 3-(dimethylamino)-1-propylamine derivative | Sigma | 90771-1G | |
Boric acid | Fisher Sci | BP168-500 | |
Sodium Tetraborate Decahydrate | Fisher Sci | BP175-500 | |
Rhodamine B | Aldrich Chem | R95-3 | |
Nitrogen gas | Airgas | UN1066 | |
Trypan blue | Thermo Sci | SV30084.01 | |
3 ml plastic Luer-lock syringe | BD | 309657 | |
Luer-lock Needle | Air-Tite | 8300014471 | 4 inch, 22 gauge |
50 ml polypropyene centrifuge tube | Falcon | 352098 | |
250 ml centrifuge bottle | Thermo Sci | 05-562-23 | Nalgene PPCO |
5 ml centrifuge tubes | Argos-Tech | T2076 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Bio Plas | 4150 | |
0.1 μm Syringe filter | Whatman | 6786-1301 | Puradisc 13 mm nylon filter |
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit | Thermo Sci | 69590 | 20,000 MWCO |
Rotary Evaporator | Heidolph | ||
Centrifuge 5072 | Eppendorf | Swinging Bucket with 50 ml tube adapters | |
Lambda 650 UV/VIS Spectrometer | Perkin Elmer | UV-Vis Spectrophotometer | |
LS 55 Fluorescence Spectrometer | Perkin Elmer | Fluorometer | |
Axio Observer.A1 | Zeiss | epifluorescence microscope | |
AxioCam MRm | Zeiss | CCD Camera | |
Tecnai TF20 Microscope | FEI | Transmisison Electron Miscroscope | |
TEM Eagle CCD | FEI | TEM CCD Camera | |
NanoBrook Omni DLS | Brookhaven | Dynamic Light Scattering Instrument |
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Tags
化学,第108,量子点,合成,磷化铟,细胞成像,纳米粒子,荧光Erratum
Formal Correction: Erratum: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications
Posted by JoVE Editors on 02/29/2016.
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Katye M. Fichter
from:
Kathryn M. Fichter.