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Chemistry

Synthese von Cd-frei InP / ZnS-Quantenpunkte Geeignet für biomedizinische Anwendungen

Published: February 6, 2016 doi: 10.3791/53684
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, Missouri State University, 2Center for Molecular Microscopy, Leidos Biomedical Research, Inc., Frederick National Laboratory for Cancer Research

ERRATUM NOTICE

Introduction

Quantum Dots (QD) sind halbleitende Nanokristalle, die fluoreszierende Eigenschaften aufweisen, wenn sie mit Licht bestrahlt ein. Aufgrund ihrer geringen Größe (2-5 nm), die viele größere Biomoleküle ähnlich ist, und eine einfache Biofunktionalisierung, QD sind ein äußerst attraktives Werkzeug für biomedizinische Anwendungen. Sie haben Verwendung in der biologischen Kennzeichnung, Einzelmolekül-Lebendzell-Imaging, Arzneimittelabgabe, in-vivo-Bildgebung, Erregernachweis und Zellverfolgung, unter vielen anderen Anwendungen gefunden 08.02.

CD-basierten Quantenpunkte wurden am häufigsten in biomedizinischen Anwendungen verwendet, wegen ihrer intensiven Fluoreszenz und schmale Emissionspeakbreiten 9. Allerdings haben Bedenken wegen der möglichen Toxizität von Cadmium angehoben worden 2+ -Ionen 10, die durch den Abbau des Nanopartikel freigesetzt werden können. Vor kurzem InP-basierten Quantenpunkte wurden als Alternative zu CD-basierten Quantenpunkte untersucht, weil sie viele Fluoreszenzeigenschaften beibehaltenvon CD-basierten Quantenpunkte und kann biokompatibler 11 sein. CD-basierten Quantenpunkte wurden signifikant toxisch zu sein als InP-basierten Quantenpunkte in in vitro-Tests in Konzentrationen so niedrig wie 10 Uhr, nach nur 48 Stunden 11 gefunden.

Die Fluoreszenzemissionsfarbe von QD ist größen abstimmbaren 1. Das heißt, wenn die Größe der QD zunimmt, nimmt die Fluoreszenzemission der roten verschoben. Die Größe und Größen Dispersität der QD-Produkte können durch Ändern der Temperatur, Reaktionsdauer, oder Vorläuferkonzentrationsbedingungen während der Reaktion 12 modifiziert werden. Während die Emissionsspitze von InP QD ist typischerweise breiter und weniger intensiv als CD-basierte QD, InP Quantenpunkte können in einer Vielzahl von Farben hergestellt werden entworfen spektrale Überlappung zu vermeiden, und 12 für die meisten Anwendungen ausreichend intensiven biomedizinischen sind. Die Synthese in diesem Protokoll detailliert ergibt QD mit einer roten Emissionsspitze bei 600 nm zentriert ist.

Sind mehrere Schritte af genommenter Synthese der QD-Kerne, die optische Integrität der Quantenpunkte zu erhalten und sie für biologische Anwendungen kompatibel zu machen. Die Oberfläche des Kern QD müssen vor Oxidation oder Oberflächenfehler geschützt werden, die dazu führen können Abschrecken; Daher wird ein ZnS Schale über den Kern beschichtet InP / ZnS (core / shell) QDS 13 zu erzeugen. Diese Beschichtung wurde die Photolumineszenz des QD Produkt zu schützen gezeigt. Die Gegenwart von Zinkionen während InP QD-Synthese wurde 12 gezeigt, um Oberflächenfehler zu begrenzen, sowie Abnahme Größenverteilung. Selbst bei der Anwesenheit von Zn 2+ in dem Reaktionsmedium, Synthese von InZnP sind höchst unwahrscheinlich 12. Nach der Beschichtung, was InP / ZnS-QDs in hydrophoben Liganden, wie Trioctylphosphinoxid (TOPO) oder Oleylamin 12,14 beschichtet. Ein amphiphiles Polymer mit hydrophoben Liganden auf der Oberfläche QD sowie Schüttwassermolekülen interagieren, um Wasserlöslichkeit 15 verleihen. Amphiphile Polymere mit carboxylate chemischen Gruppen können als "chemische Griffe" verwendet werden, um die QD funktionalisieren.

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Funktionalisierung von wasserlöslichen InP / ZnS QD mit sehr intensiven Fluoreszenzemission und relativ geringe Größe-Dispersität. Diese Quantenpunkte sind möglicherweise weniger toxisch als häufig verwendete CdSe / ZnS-Quantenpunkte. Hierin stellt die Synthese von InP / ZnS-QDs eine praktische Alternative zum CD-basierten Quantenpunkte für biomedizinische Anwendungen.

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Protocol

1. Synthese von Indium-Phosphid / Zinksulfid (InP / ZnS) Quantum Dots

  1. Synthese von Indiumphosphid (InP) Quantum Dot Cores
    1. Setzen Sie einen 100 ml Rundkolben, 3-Hals-Kolben mit einem 12-Zoll-Kondensator. Mit einem Vakuum für 1 Stunde 30 ml Oleylamin (OLA), 0,398 g Indium (III) chlorid (InCl 3), 0,245 g Zink (II) chlorid (ZnCl 2) und rühren während bei RT zu evakuieren. Die Lösung sollte mit einem weißen Niederschlag farblos erscheinen.
    2. Unter Verwendung eines Heizmantels mit einem Thermoelement und proportional-integral-derivative (PID) Temperaturregler, erhöhen die Temperatur der Lösung auf 120 ° C. Evakuieren die Lösung unter Vakuum für 20 min mit niedrigem Siedepunkt, um Verunreinigungen zu entfernen, die Kernwachstum auswirken können.
      Anmerkung: Es ist zwar möglich, ein Sandbad und Thermometer zu verwenden, unter Verwendung eines Heizmantels und PID erhöht die Homogenität und Reproduzierbarkeit der Reaktionsprodukte.
    3. Unter Schutzgas (zB, N 2), die Lösung unter Rückfluss und die Temperatur auf 220 ° C für 15 min erhöhen. Die InCl 3 und ZnCl 2 vollständig aufzulösen, wodurch eine blassgelbe Lösung. Lassen Sie die Temperatur für 10 min zu stabilisieren.
    4. Spülen Sie eine Einweg, 3 ml Kunststoffspritze und 4 Zoll, 22 G-Nadel mit Stickstoffgas. Unter Verwendung der Spritze, liefern schnell 0,5 ml Tris (dimethylamino) phosphin (TDMAP) an die InCl & sub3; -Lösung. Die Temperatur der Lösung sinkt leicht und kehrt zu 220 ° C. Die Lösung ändert sich von transparent, hellgelb bis opak, schwarz.
    5. Nach 9,5 min, der Reaktionskolben aus dem Heizmantel entfernen, bis die Temperatur unter 200 ° C sinkt. Um die Integrität der InP-Kerne schützen, gehen direkt an die ZnS-Beschichtung in Schritt 1.2.1.
  2. Synthese von Zinksulfid (ZnS) Quantum Dot Shells
    1. Setzen Sie den Reaktionskolben aus Schritt 1.1.5 auf einem Heizpilz und stabilisieren die temperatur bei 200 ° C. Langsam 3,58 g Dodecanthiol (DDT) im Verlauf von 15 sec auf die Lösung, die InP-Quantenpunkte hinzuzufügen. Lassen Sie die Lösung für 1 Stunde zu reagieren.
      Anmerkung: ZnS Schalendicke kann durch Erhöhen oder Verringern der Menge an Zinkstearat in Schritt 1.2.4 hinzugefügt variiert werden. Die Veränderung der Menge an ZnCl 2 oder Dodecanthiol in Schritten 1.1.1 und 1.2.1 kann erheblich die Qualität der Quantenpunkte beeinflussen, indem sie die Reaktionskinetik zu ändern.
      1. Danach entfernen die Reaktionskolben aus dem Heizmantel und die Lösung auf etwa 60 ° C zu kühlen.
    2. Sobald die InP / ZnS Lösung erreicht ~ 60 ° C, 10 ml Hexan und übertragen die gesamte Lösung von etwa 45 ml bis 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Probe (3.000 × g für 10 min) nicht umgesetzten festen Vorläufer zu entfernen.
    3. übertragen Sie vorsichtig den Überstand in ein 250-ml-Polypropylen-Zentrifugenflasche, 200 ml Aceton und Zentrifuge die Lösung (3.000 xg für 10 min) InP / ZnS QDs auszufällen. Dieses Volumen kann auch gleichmäßig in vier 50-ml-Röhrchen für die Zentrifugation aufgespalten werden, wenn eine Zentrifuge mit den notwendigen Rotor / Zubehör, das nicht zur Verfügung steht. Dekantieren des Überstandes und trocknen Sie die QD Pellet gründlich mit Stickstoffgas Aceton zu entfernen.
    4. Resuspendieren der Quantenpunkte in 20 ml OLA Beschallung verwenden, übertragen auf einen 50 ml Rundboden, 3-Hals-Kolben mit 0,474 g Zinkstearat und umrühren. Evakuieren die Lösung unter Vakuum für 20 min bei RT.
    5. Unter Stickstoffgas, die Temperatur auf 180 ° C erhöht und damit die Reaktion 3 Stunden ablaufen. Zwar gibt es keine merklichen visuellen Änderungen zu der Reaktionslösung, die bei dieser Reaktion auftreten, erhöht Dicke ZnS Schale Zinkstearat Hinzufügen somit QY Erhöhung durch Oberflächenpassivierung QD 12 zu verbessern. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, die Kolben aus dem Heizmantel entfernen und die Lösung auf etwa 60 ° C zu kühlen.
    6. Sobald die InP / ZnS solutiauf Lauf ~ 60 ° C, in den ein 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen 20 ml Hexan und übertragen. Zentrifugieren Sie die Probe (3.000 × g für 10 min) auf nicht umgesetzte Zinkstearat entfernen.
    7. übertragen Sie vorsichtig den Überstand in ein 250-ml-Polypropylen-Zentrifugenflasche, 200 ml Aceton und Zentrifuge die Lösung (3000 g für 10 min) InP / ZnS-QDs zu fällen. Dekantieren Sie vorsichtig den Überstand und gründlich mit Stickstoffgas trocken Aceton zu entfernen.
    8. Man löst den InP / ZnS QD Pellet in 30 ml Hexan. Vortex und beschallen die Lösung kurz vollständige Dispersion zu gewährleisten.
    9. Wiederholen Reinigungsschritte 1.2.6-1.2.8 zwei weitere Male gründliche Entfernung von überschüssigem organischen Liganden zu gewährleisten. Wechselwirkungen zwischen dem amphiphilen Polymer und dem QD in Schritt 1.2 kann in Gegenwart von überschüssigem Liganden beeinträchtigt werden.
    10. Mit Berechnungen von Xie detailliert, et al. 16, bestimmen die Größe und Konzentration der synthetisierten InP / ZnS-QDs mit UV-Vis-Spektroskopie.

2. WasserSolubilisierung von InP / ZnS-Quantenpunkte unter Verwendung eines amphiphilen Polymers

  1. Wasser Solubilisierungsmethode
    1. Unter Verwendung der InP / ZnS QD aus Schritt 1.2.10, verdünnte einen Teil der Quantenpunkte mit Hexan von 1 uM QD zu erhalten 1 ml.
      1. In einem Zentrifugenröhrchen, übertragen 0,25 ml InP / ZnS-QDs in jedes Röhrchen. 1 ml Aceton oder Methanol zu dem Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge (3.000 × g für 10 min). Den Überstand sorgfältig entfernen und jeder Niederschlag in 1 ml Tetrahydrofuran (THF) lösen.
      2. Übertragen Sie die InP / ZnS-QDs in THF in einen 100-ml-Rundkolben und verdünnt mit 16 ml THF. Um die Anzahl der Aggregate in der Lösung reduzieren, beschallen die Quantenpunkte für 5-10 min.
    2. Man löst 30 mg Poly (Maleinsäureanhydrid andhydride- alt -1-Octadecen), 3- (Dimethylamino) -1-propylamin (pMAL-d) in 10 ml Molekularreinem Wasser. Wasserbad Beschallung oder leichtem Rühren, bis die Lösung durchscheinend ist ausreichend, um das Polymer vollständig aufzulösen. DasVerwendung von Wirbel oder kräftigem Rühren kann viele Blasen erzeugen, die Wechselwirkung des Polymers mit dem QD behindert. In den 10 ml Polymerlösung auf den 100-ml-Rundkolben, der InP / ZnS-QDs in THF.
    3. Verdampfen THF aus dem QD / Polymerlösung mit einem Rotationsverdampfer. Der Kolben wird in einem Eisbad während Eindampfen der Wechselwirkung zwischen dem Polymer und QD zu erleichtern. Je nach Stärke des Vakuums wird das meiste THF nach 10 min verdampft und die Lösung wird trüb.
      1. Sobald die Lösung auf 10 ml eingedampft wird, der Kolben vom Rotationsverdampfer entfernen und 30 ml molekularen Grad Wasser. Bringen Sie den Kolben am Rotationsverdampfer und weiter bis 2 ml zu verdampfen. Dieser letzte Verdampfungsschritt kann viele Stunden dauern; sicherzustellen, das Eisbad aufrechterhalten wird.
    4. Entfernen Sie die wasserlöslichen InP / ZnS-QDs aus dem Rundkolben mit einer Pipette. Filtern Sie die QD-Lösung mit einer 3 ml-Kunststoffspritze an einem 0,1 um Nylon syringe filtriert in ein 5 ml Zentrifugenröhrchen.
    5. Legen Sie die Quantenpunkte in einer 20.000 MWCO-Membran Dialysestation und Dialyse gegen 0,05 M Boratpuffer pH 8,5, um überschüssige Polymer entfernen. (Langsam 0,05 M Natriumtetraborat-Decahydrat und 0,05 M Borsäure, unter starkem Rühren, bis der pH 8.5 ist diese Boratpufferlösung zu machen.) Einen Vakuumkonzentrator Verwendung konzentrieren sich die Quantenpunkte in Boratpuffer auf 1 ml.
    6. Für die Lagerung, Säuberung der Lösung mit Stickstoffgas vor mit Parafilm versiegelt. Die wasserlöslichen InP / ZnS QD sind stabil für mindestens 4 Monate bei 4 ° C im Dunkeln.

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Representative Results

Die unbeschichteten InP Kerne zeigen keinen wesentlichen sichtbare Fluoreszenz mit dem Auge. Allerdings InP / ZnS (core / shell) Quantenpunkte erscheinen hell unter UV-Bestrahlung von Auge zu fluoreszieren. Die Fluoreszenz von InP / ZnS-QDs wurde mit Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert. Das Fluoreszenzspektrum von QD in Hexanen (Abbildung 1) bei 533 nm angeregt wird mit einer Halbwertsbreite (FWHM) von 73 nm bei 600 nm zentriert einen Hauptpeak zeigt. Während Extinktion (0.2) in Abbildung Offset 1 QD Licht bedeuten könnte Streuung und damit die Anwesenheit von aggregierten QD, Analyse zu blinken (siehe unten) zeigen, dass die meisten Quantenpunkte sind einzelne oder sehr kleine Gruppen von QD. Nach der Beschichtung mit der amphiphilen Polymer pMAL-d wurde die Quantenausbeute von InP / ZnS QDs durch Vergleich der integrierten Fluoreszenzintensität der Quantenpunkte mit Rhodamin B als Standard-17 untersucht. Die Quantenausbeute von Quantenpunkte in Hexan wurde determined durchschnittlich 7,96% betragen (2 Messungen, 7,69% und 8,22%) und 6,03% in Wasser im Durchschnitt (2 Messungen, 5,98% und 6,08%).

Die Größe der wasserlöslichen InP / ZnS QDs wurde unter Verwendung sowohl der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und dynamische Lichtstreuung (DLS) charakterisiert. TEM-Bilder, die nur die Nanokristall-Kern und Schale (InP / ZnS) sichtbar zu machen, nicht organischen Liganden auf der Oberfläche wurden bei einer nominalen Vergrößerung von 150,000X erfasst. Die Bilder wurden mit Fiji ImageJ 18 analysiert und die Schwelle eingestellt wurde binären Bildern zu geben. Die minimalen und maximalen Feret-Durchmesser wurden gemittelt, um die Durchmesser dieser wasserlöslichen Quantenpunkte zu bestimmen. Diese Daten zeigten kleine, relativ monodisperse QD mit einem mittleren Durchmesser von 2,74 ± 0,72 nm (2A & B). Die effektive hydrodynamische Durchmesser der QD in Wasser bei pH 7, eingekapselt in pMAL-d, wurde unter Verwendung von DLS gemessen. Es sollte seinbeachten, dass die effektiven hydrodynamischen Durchmesser über DLS die solvatisierten QD, einschließlich organischen Liganden und Polymeren auf der Oberfläche des QD sowie Wassermoleküle, die mit ihnen interagieren misst. Daher sind DLS Messungen im allgemeinen viel größer als Messungen in TEM-Experimenten erhalten. Bei dieser Messung wurden QD angenommen kugelförmig sind und insgesamt 30 Messungen wurden die effektiven Durchmesser Volumenteillösungen BIC Software zur Berechnung erfasst. Diese Werte wurden gemittelt, einen durchschnittlichen Durchmesser von 14,8 ± 6,0 nm (2C) bereitstellt.

Wenn die synthetisierten InP / ZnS-QDs, um zu bestimmen, um geeignete waren für Einzelmolekül-Imaging, blinkende Analyse durchgeführt wurde unter Verwendung von Epifluoreszenzmikroskopie 8. Während es nicht möglich ist, einzelne Quantenpunkte unter Verwendung von Lichtmikroskopie, die Analyse der "on" und "off" Fluoreszenzemissionszustände sehen s zur Identifizierung verwendet werden,ingle QD puncta in Fluoreszenzbilder. Ein puncta eine einzelne blinkende Quantenpunkt darstellt, zeigt eine "Ein" -Zustand, die aus dem "Aus" -Zustand differenziert wird. Ein Film von Blinken QD (auf etwa 100 pM in entionisiertem Wasser verdünnt) wurde unter Verwendung eines 63X, objektiven 1,4 NA Öl-Immersions auf einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem geeigneten Filterwürfel und CCD-Kamera ausgestattet erfasst. Die Bilder wurden nacheinander für 500 Frames mit 30 ms Belichtung aufgenommen. Blinkt Analyse wurde durch die Analyse der durchschnittlichen Intensität eines einzelnen puncta (ungefähr 4 Pixel) in jedem Rahmen durchgeführt ImageJ 19 (Abbildung 3A). Die deutliche Lücke zwischen der "Ein" und "Aus" -Zustand der Quantenpunkte zeigen ihr Potenzial für die Einzelmolekül-Imaging (3B).

Das Zusammenwirken der InP / ZnS QDs mit Zellen wurde auch durch beide Toxizität und zelluläre Internalisierung untersucht. FürBeide Studien, mouse neuroblastoma (N2a) -Zellen wurden verwendet, und alle Experimente wurden in Zellmedium (50/50 D-MEM / Opti-MEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Antibiotika / Antimykotika) durchgeführt. Ein Trypanblau Toxizität Test 20 wurde durch Inkubation von N2a Zellen für 24 und 48 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von QD durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen vernachlässigbare Toxizität von N2a Zellen bei QD Konzentrationen zwischen 1-5 nm (Abbildung 4). Um QD Internalisierung beobachtet wurden N2a Zellen sowohl mit wasserlöslichen InP / ZnS QD für 12 h bei 5 und 10 nM inkubiert. Bilder mit diesen QD inkubierten Zellen scheint eine lysosomale Lokalisierung von QD nach 12 h (Abbildung 5) zeigen, die mit anderen Internalisierung Ergebnisse von Nanopartikeln 21 konsistent ist.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Absorption und Fluoreszenz-Charakterisierung InP / ZnS-QDs. Absorption und korrigierten Fluoreszenzemissionsspektren von InP / ZnS in Hexan bei 533 nm angeregt, eine maximale Absorption bei 600 nm und einer Halbwertsbreite von 73 nm zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Größenanalyse von Polymer-beschichteten InP / ZnS-QDs in Wasser. (A) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von InP / ZnS-QDs in Wasser gelöst (Balken = 50 nm). (B) Partikelgrößenverteilung Histogramm der TEM-Ergebnisse mit einem mittleren Durchmesser von 2,74 ± 0,72 nm. (C) Dynamische Lichtstreuung Analyse von InP / ZnS-QDs in Wasser mit einer mittleren hydrodynamischen Durchmesser von 14,8 ± 6,0 nm zeigt.large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Blinken Analyse von InP / ZnS-QDs. Einzelne fluoreszierende puncta Analyse Detaillierung das Vorhandensein von unterschiedlichen "on" und "off", so durch (A) ein blinkendes Profil von InP / ZnS-QDs in Wasser 460 nm ± 25 nm Anregungsfilter , 500 nm langen Pass Emissionsfilter und 475 nm dichroitischen Spiegel, und (B) ein Histogramm, das die bimodale Verteilung der Pixel-Intensität von einer QD blinkt Profil zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
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Abbildung 5
Abbildung 5. Internalisierung von InP / ZnS-QDs in N2a Zellen. Fluoreszenzaufnahme, welche die Internalisierung von InP / ZnS-QDs nach 12 h Inkubation mit 0 nM Kontrolle (A) DIC (B) QD, und (C) Überlagerung, nach 12 Stunden zeigt, Inkubation mit 5 nM QD (D) DIC (E) QD, und ( (G) DIC (H) QD, und (I) Überlagerung. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese hochFluoreszenz InP / ZnS QD, die in vielen biologischen Systemen verwendet werden können. Die QD-Produkte hier synthetisiert zeigte einen einzelnen Peak Fluoreszenzemission bei 600 nm mit einer FWHM von 73 nm (Abbildung 1) zentriert ist, die zu anderen zuvor beschriebenen Synthesen 12 vergleichbar ist. Die Reaktionszeit und Reaktionstemperatur sind sehr wichtige Schritte wegen ihrer tiefgreifende Wirkung auf QD Synthesequalität und Reproduzierbarkeit. Nach der Solubilisierung in Wasser wurden die Quantenpunkte bestimmt, um eine Quantenausbeute von etwa 6% zu haben. Variation der Reaktionszeit, Temperatur oder Vorstufenkonzentration ermöglicht die Abstimmung des QD Größe und Emissionswellenlänge, die in multispektrale Anwendungen verwendet werden kann.

Größe und Oberflächenladung sind extrem wichtige Faktoren zu berücksichtigen, wenn Nanopartikel in biologischen Systemen. Zur Minimierung der Störung der Ziel Biomoleküle, sollte QD halten einen kleinen, monodisperse Größe. Darüber hinaus kann die Oberflächenladung von QD in Lösung modifiziert werden unspezifische zu verringern gegenüber unspezifischen Targets binden. Die Synthese von QD präsentiert hier hergestellten Quantenpunkte mit einem Durchmesser von 2,74 ± 0,72 nm mittels TEM (nur der Kern und Schale sind sichtbar) (2A und 2B). Wasserlösliche QD gefunden einer effektiven hydrodynamischen Durchmesser von 14,8 ± 6,0 nm aufweist, die CD-basierte QD vergleichbar ist derzeit für biologische Untersuchungen verwendet 22. Die Oberflächenladung und Funktionalität von wässrigen QD kann durch Weiterreaktion der carboxylat chemischen Gruppen des amphiphilen Polymers modifiziert werden.

Blinkende Analyse wurde verwendet, um die Eignung dieser InP / ZnS für Einzelmolekül-Imaging-Studien zu erforschen. Da es nicht möglich ist, einzelne Quantenpunkte unter Verwendung von Lichtmikroskopie sichtbar zu machen, kann das Blinken einzelner Quantenpunkte verwendet werden, um einzelne Teilchen zu identifizieren. Das blinkende Phänomen ist der Wechsel zwischen diskreter &# 34; an "und" aus "Fluoreszenz 23 Staaten, die der Durchschnittspixelintensität der einzelnen fluoreszierenden QD puncta im Laufe der Zeit untersucht werden, um die Fluoreszenz Spuren von InP / ZnS QD puncta charakteristische demonstrieren." Ein "und" Aus "-Zustand ( 3A). Darüber hinaus gibt es keine Überlappung zwischen dem "ein" und "aus" Zustände eines Einzel puncta (3B), die in früheren Studien verwendet wurde 8 Einzelpartikel zu unterscheiden.

Weitere Experimente wurden verwendet, um die Eignung dieser InP / ZnS-QDs für Mobilstudien zu erforschen. Ein Trypanblau-Toxizitätstest wurde ausgeführt, um die Biokompatibilität der InP / ZnS QD zu beurteilen. Nach Inkubation für 24 Stunden bis zu 48 Stunden bei QD Konzentrationen im Bereich von 1 bis 5 nM, wurde vernachlässigbare Toxizität beobachtet (Abbildung 4), die Toxizitätsstudien für InP / ZnS QD 11 vergleichbar ist. Erhebliche Toxizität wurde nicht beobachtet below 25 nM; Diese Konzentration ist wesentlich höher als für viele biomedizinische Anwendungen erforderlich. Beispielsweise erfordern Einzelmolekül-Imaging-Studien häufig pM Konzentrationen des QD Sonde eine repräsentative Anzahl von oberflächengebundenen zellulären Rezeptoren 24 zu kennzeichnen. Zusätzlich mit QD bei 5 nM oder 10 nM für 12 Stunden inkubiert N2a Zellen in Zellmedien zeigen, dass QD über Endozytose internalisiert werden, das heißt, zeigen QD ein gepunktetes Färbungsmuster innerhalb der Zellen (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen die Eignung dieser InP / ZnS QD für zelluläre Prozesse zu untersuchen.

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Funktionalisierung von wasserlöslichen InP / ZnS-QDs mit intensiven Fluoreszenzemission, relativ kleine Größe-Dispersität und biologische Verträglichkeit. Die hohe Qualität dieser QD Produkte wird durch die Visualisierung einzelner Quantenpunkte in der Fluoreszenzmikroskopie angegeben, die zeigt, dass sie geeignet sind für Single-moleculE-Bildgebung. Es wird erwartet, dass diese Cd freien QD sind potentiell viel weniger giftig für den biologischen Systemen untersucht, sowie die Forscher sie studieren. Als solches ist die Verwendung dieser In-basierten Quantenpunkte für biomedizinische Anwendungen eine vernünftige Alternative zu CD-basierten Quantenpunkte.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren danken dem Institut für Chemie und das Graduiertenkolleg in Missouri State University für ihre Unterstützung dieses Projektes. Wir erkennen auch die Elektronenmikroskopie-Labor an der Friedrich National Laboratory for Cancer Research für die Nutzung ihrer Transmissionselektronenmikroskop und kohlenstoffbeschichtetes Gitter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oleylamine Acros 129540010
Zinc(II) chloride Sigma 030-003-00-2
Indium(III) chloride Chem-Impex 24560
Tris(dimethylamino)phosphine Encompass 50-901-10500
1-dodecanethiol Acros 117625000
Hexanes Fisher Sci H292-4
Acetone TransChemical UN 1090
Zinc Stearate Aldrich Chem 307564-1KG
Tetrahydrofuran Acros 34845-0010
Molecular Water Fisher Sci BP2470-1
Poly(maleic anhyrdride-alt-1-tetradecene), 3-(dimethylamino)-1-propylamine derivative Sigma 90771-1G
Boric acid Fisher Sci BP168-500
Sodium Tetraborate Decahydrate Fisher Sci BP175-500
Rhodamine B Aldrich Chem R95-3
Nitrogen gas Airgas UN1066
Trypan blue Thermo Sci SV30084.01
3 ml plastic Luer-lock syringe BD 309657
Luer-lock Needle Air-Tite 8300014471 4 inch, 22 gauge
50 ml polypropyene centrifuge tube Falcon 352098
250 ml centrifuge bottle Thermo Sci 05-562-23 Nalgene PPCO
5 ml centrifuge tubes Argos-Tech T2076
1.5 ml microcentrifuge tubes Bio Plas 4150
0.1 μm Syringe filter Whatman 6786-1301 Puradisc 13 mm nylon filter
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Unit Thermo Sci 69590 20,000 MWCO
Rotary Evaporator Heidolph
Centrifuge 5072 Eppendorf Swinging Bucket with 50 ml tube adapters
Lambda 650 UV/VIS Spectrometer Perkin Elmer UV-Vis Spectrophotometer
LS 55 Fluorescence Spectrometer Perkin Elmer Fluorometer
Axio Observer.A1 Zeiss epifluorescence microscope
AxioCam MRm Zeiss CCD Camera
Tecnai TF20 Microscope FEI Transmisison Electron Miscroscope
TEM Eagle CCD FEI TEM CCD Camera
NanoBrook Omni DLS Brookhaven Dynamic Light Scattering Instrument

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References

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Chemie Heft 108 Quantenpunkte Synthesis Indiumphosphid Cellular Imaging Nanopartikel Fluoreszenz

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Formal Correction: Erratum: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications
Posted by JoVE Editors on 02/29/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications. There was an error with an author's given name. The author's name was corrected to:

Katye M. Fichter

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Kathryn M. Fichter.

Synthese von Cd-frei InP / ZnS-Quantenpunkte Geeignet für biomedizinische Anwendungen
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Ellis, M. A., Grandinetti, G.,… More

Ellis, M. A., Grandinetti, G., Fichter, K. M. Synthesis of Cd-free InP/ZnS Quantum Dots Suitable for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (108), e53684, doi:10.3791/53684 (2016).

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