В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина
Summary
Здесь мы представляем роман Ca 2+ -imaging подход с использованием биолюминесцентного репортера. Этот подход использует конденсированную конструкт GFP-экворин, который связывается с Са 2+ и излучает свет, устраняя необходимость в возбуждении светом. Значительно этот метод позволяет длительной непрерывной визуализации, доступ к глубинных структур головного мозга и высоким временным разрешением.
Abstract
Функционал естественных изображений стала мощным подход к изучению функции и физиологию клеток головного мозга и структур, представляющих интерес. Недавно был разработан новый метод Ca 2+ -imaging помощью биолюминесценции репортер GFP-экворин (GA). Этот новый метод опирается на слияния GFP и экворин генов, производя молекулу, способную связываться кальций и – с добавлением его кофактора коэлентеразина – излучающих яркий свет, который можно наблюдать через фотонов коллектора. Трансгенные линии, несущие ген GFP в-экворин были получены для мышей и Drosophila. У Drosophila, ген GFP-экворин был помещен под контроль системы двоичной GAL4 / UAS позволяет направленной экспрессии и визуализации в головном мозге. Этот метод впоследствии было показано, чтобы быть способным обнаруживать и внутрь Ca 2+ -transients и Са 2+ -released от внутренних магазинов, Самое главное это позволяет в большей продолжительности в непрерывной записи изображений на больших глубинах в пределах мозга, и записи на высоких временным разрешением (до 8,3 мс). Здесь мы представляем основной метод для использования биолюминесцентного изображений для записи и анализа Ca 2+-активности в течение грибных тел, структуру центрального к обучению и памяти в летучей мозга.
Introduction
Основная рисунка и функции деятельности в головном мозге и его отдельных структур уже давно является областью интенсивного изучения в области неврологии. Возможно, некоторые из самых ранних успешных подходов, используемых для решения этого вопроса были прямыми физиологическое измерение изменения в электрической активности – однако альтернативные методы, которые позволяют жить визуализации изменений напряжения, рН или кальция концентрации (как прокси-сервер для деятельности) привели дополнительные возможности для изучение нейронной активности 1. Методы визуализации выполнять широкий спектр преимуществ, таких как снижение инвазивности и способности контролировать деятельность в целом структур головного мозга. Кроме того, в животных с послушными генетики в том числе плодовой мушки дрозофилы, развитие генетически кодируемых показателей кальция, таких как Cameleon, GCaMPs и других 1 позволили исследователям следить одиночные нейроны, нейронные популяции и весь мозгструктуры. В то время как более традиционные люминесцентные методы визуализации кальция с помощью GCaMPs (GFP, слитый с кальмодулина) или беспокоиться (CFP и YFP, слитый с кальмодулина) оказались полезные методы, обеспечивающие хорошее пространственное и временное разрешение, основной процесс светового возбуждения порождает некоторые ограничения на его экспериментальное Приложения. Из-за природы света возбуждения, флуоресценции, фото-отбеливания, и фототоксичности неизбежно производимого, которые, следовательно, ограничивает глубину структур, которые могут быть отображаемого, продолжительность записи, а также непрерывность реального времени записи. Другими словами, записи, часто должна быть выполнена с перерывами, чтобы избежать этих нежелательных побочных эффектов.
Из-за этих проблем, были разработаны дополнительные альтернативные методы визуализации кальция. Одним из наиболее перспективных методов биолюминесцентного изображений, которая опирается на свете получаемой посредством ферментативной реакции после связывания кальция. Bioluminescenт изображения не требует света возбуждения и, следовательно, не испытывает те же трудности, как и обычные изображения кальция. Биолюминесцентного репортера акворина – изолирован от Aequorea Виктория, то же самое, из которого медузы GFP был также isolated- связывает кальций помощью трех ручных EF структур и проходит конформационное изменение, что приводит к окислению его кофактора коэлентеразином и выхода синего света (λ = 469 нм) 2,3. Акворина имеет очень низкое сродство к кальцию (K D = 10 мкм), что делает его идеальным для мониторинга переходных кальция, поскольку он производит очень мало шума и фонового не мешает системе буферизации внутриклеточного кальция 4. Хотя экворин ранее использовался для наблюдения за процессом индукции нервной в Xenopus яйца 5 свет производится слишком тусклый, чтобы использовать для реального времени визуализации нейронной активности. В целях решения этой проблемы, Филиппа Br &# 251; пусть и коллеги в Институте Пастера создали генетическую конструкцию слияния GFP и экворин гены, имитируя естественное состояние в 4 медуз. Этот ген слитого продукта связывает кальций снова с помощью трех ручных EF структур акворина, которые претерпевает конформационное изменение, ведущий к окислению коэлентеразином, который передает энергию без радиационно к GFP. Эта передача энергии приводит к высвобождению зеленого света (λ = 509 нм) с GFP, а не синим светом от акворина. Слияние GFP и акворина также придает большую стабильность белка помогает слитого белка производят свет от 19 до 65 раз ярче, чем в одиночку экворин 4. Использование биолюминесцентного подход в головном мозге расширяется текущее экспериментальное использование визуализации кальция как с точки зрения длительности непрерывной записи и количества структур в головном мозге, которые могут быть записаны. В широком смысле в контексте предыдущей работы это означает, что как глобальные и большееРазнообразие регионализации "деятельности" мозга могут контролироваться (через прокси-сервер переходных кальция). Что еще более важно деятельность может контролироваться дольше, в режиме реального времени и постоянной основе, которые легко поддается погоне за полного понимания базисной функции в головном мозге.
В последние несколько лет, наша лаборатория и другие разработали трансгенных мух, выражающие GFP-экворин под контролем двоичной системе экспрессии (GAL4 / UAS-GFP-экворин) 5,6. Мы использовали GFP-экворин биолюминесценции для записи активности при естественных раздражителей, таких как запах 7,8, а также изученных клеточных компонентов, модулирующих Ca 2+-активности в грибных тел следующих рецептора ацетилхолина стимуляции прямой никотиновой применения 9. Кроме того, мы также использовали GFP-экворин решить ряд экспериментальных вопросов, которые не смогли быть рассмотрены ранее, как долгосрочныеизображения спонтанных переходных кальция и визуализации глубоких структур головного мозга 10. Совсем недавно мы использовали систему / UAS GAL4 выразить млекопитающих рецептор АТФ Р2Х 2 11 катион канала, в проекционных нейронов (ПНС) и использовать систему Lexa, чтобы выразить GFP-экворин в грибных тел (MB247-Lexa, 13XLexAop2-ИВС-G5A-ВР) (любезность Б. Пфайффер, Janelia Farm, США). Это позволило нам активизировать ПН применением СПС, в свою очередь, активирует грибные тела (вниз по течению целевых ПНС), имитируя более естественные условия, такие как ответ на запах раздражитель. В целом этот метод объединения Р2Х 2 и GFP-экворин расширяет экспериментальные возможности. В широком смысле это дает возможность лучше понять закономерности деятельности мозга, инициируя новые исследования о том, как различные стимулы и возмущения могут изменять базальную паттерна активности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Недавно разработанный биолюминесцентного основе GFP-экворин Представленный здесь подход позволяет в естественных условиях функциональной записи Ca 2+-активности в различных нейронов, а также, при желании, в другой вид клеток, таких как почки звездчатых клеток, как сообщается ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Riferimenti
- Martin, J.-R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose? J Neurogenet. 22(3), 285-307, (2008).
- Shimomura, O., & Johnson, F.H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75(6) 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F.H., & Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62(1), 1-8, (1963).
- Baubet, V. et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97(13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S.A., Dow, J.A.T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280(1757), 2012-2943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S.E., Daguzan, C., Moreau, M., & Miller, A.L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113(19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J.-R., Rogers, K.L., Chagneau, C., & Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2(3), e275, (2007).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., & Martin, J.-R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213(24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., Réal, E., & Martin, J.-R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105, (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., & Martin, J.-R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2(2), 0054-0068, (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M.S., & Martin, J.-R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833(7), 1632-1640, (2013).
- Lima, S.Q., & Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121(1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., & Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14(5), 373-378, (1993).
- Berridge, M.J., Bootman, M.D., & Roderick, H.L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4(7), 517-529, (2003).
- Fiala, A., & Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003(174), PL6, (2003).
- Wang, J.W., Wong, A.M., Flores, J., Vosshall, L.B., & Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112(2), 271-282, (2003).
- Wilson, R.I., Turner, G.C., & Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303(5656), 366-370, (2004).
