In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin
Summary
Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.
Abstract
Funktionelle in-vivo-Bildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz, um die Funktion und Physiologie von Gehirnzellen und Strukturen von Interesse zu studieren. Vor kurzem wurde ein neues Verfahren zur Ca 2+ -Imaging Verwendung des Biolumineszenz-GFP-Reporter Aequorin (GA) ist entwickelt worden. Diese neue Technik beruht auf der Fusion von GFP und Aequorin Genen, wodurch ein Molekül in der Lage zum Binden von Calcium und – unter Zugabe von dessen Co-Faktor Coelenterazin – emittierende helle Licht, das durch ein Photon Sammler überwacht werden können. Transgene Linien Tragen des GFP-Aequorin-Gens für Mäusen und Drosophila erzeugt. Bei Drosophila wurde die GFP-Aequorin-Gen unter der Kontrolle des GAL4 / UAS Binärausdruck Systems für die gezielte Expression und Imaging im Gehirn platziert. Dieses Verfahren wurde später gezeigt, dass sie erfassen kann sowohl nach innen Ca 2+ -Transienten und Ca 2+ aus inneren speichert -released. Am wichtigsten ist es ermöglicht eine größere Dauer in eine kontinuierliche Aufzeichnung, Imaging in größerer Tiefe innerhalb des Gehirns, und die Aufzeichnung mit hoher zeitlicher Auflösung (bis zu 8,3 ms). Hier präsentieren wir die grundlegende Methode für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung zu erfassen und zu analysieren, Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern, die eine Struktur von zentraler Bedeutung für Lernen und Gedächtnis im Fliegenhirn.
Introduction
Die grundlegende Strukturierung und Funktion der Aktivitäten innerhalb des Gehirns und seiner diskreten Strukturen sind seit langem ein Gebiet intensiver Studie auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Vielleicht einige der frühesten erfolgreiche Ansätze verwendet werden, um dieses Problem zu beheben waren direkte physiologische Messung der Änderung in der elektrischen Aktivität – aber alternative Methoden, die Live-Darstellung von Spannungsänderungen, pH-Wert oder Calciumkonzentrationen (als Proxy für die Aktivität) zu ermöglichen haben zusätzliche Fähigkeiten gebracht die Untersuchung der neuronalen Aktivität 1. Bildgebungstechniken tragen eine Vielzahl von Vorteilen, wie reduzierte Invasivität und die Fähigkeit, im gesamten Gehirnstrukturen zu überwachen Aktivität. Außerdem bei Tieren mit gefügig Genetik einschließlich der Fruchtfliege Drosophila, die Entwicklung von genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren, wie Cameleon, GCaMPs und andere 1 haben Forscher erlaubt, einzelne Nervenzellen, neuronale Populationen und ganzer Gehirn überwachenStrukturen. Während traditionelle fluoreszierende Kalzium-bildgebenden Verfahren unter Verwendung GCaMPs (GFP an Calmodulin fusioniert) oder FRET (CFP und YFP an Calmodulin abgesichert) haben sich als nützliche Techniken eine gute räumliche und zeitliche Auflösung zu sein, die zugrunde liegende Prozess der Lichtanregung erzeugt einige Einschränkungen auf seine experimentelle Anwendungen. Aufgrund der Natur der Lichtanregung, Autofluoreszenz, Photobleaching und Phototoxizität unvermeidlich erzeugt wird, was folglich begrenzt die Tiefe der Strukturen, die abgebildet werden kann, die Dauer der Aufnahme sowie die Echtzeit-kontinuierliche Aufzeichnung. In anderen Worten muss Aufzeichnungen oft intermittierend durchgeführt werden, um diese unerwünschten Nebenwirkungen zu vermeiden.
Wegen dieser Probleme wurden zusätzliche alternative Verfahren der Calcium Bildgebung entwickelt. Einer der vielversprechendsten Methoden ist biolumineszierenden Bildgebung, die auf Licht, das durch eine enzymatische Reaktion nach der Calciumbindung hergestellt beruht. Bioluminescent-Bildgebung erfordert keine Lichtanregung und damit nicht die gleichen Schwierigkeiten wie herkömmliche Calcium Imaging zu erleben. Die Biolumineszenz Reporter Aequorin – von Aequorea victoria isoliert, das gleiche Quallen, von dem GFP wurde auch isolated- bindet Kalzium über seine drei EF-Hand-Strukturen und eine Konformationsänderung, die zur Oxidation von seinem Co-Faktor Coelenterazin und die Freisetzung von blauem Licht (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin hat eine sehr niedrige Affinität für Calcium (K d = 10 & mgr; M), was es ideal für die Überwachung Calciumtransienten weil sie erzeugt nur wenig Hintergrundrauschen und nicht mit der intrazellulären Calcium-Puffersystem 4 eingreifen lässt. Obwohl Aequorin bereits verwendet wurde, um den Prozess der neuronalen Induktion im Xenopus-Ei 5 das erzeugte Licht zu überwachen, ist zu schwach, um für eine Echtzeitabbildung der neuronalen Aktivität verwendet werden. In dem Bemühen, diese Herausforderung, Philippe Br & Adresse# 251; lassen und Kollegen am Institut Pasteur erstellt ein genetisches Konstrukt Verschmelzen GFP und Aequorin Genen, imitiert den nativen Zustand in der Quallen 4. Dieses Fusions Genprodukt bindet Calcium wieder über die drei EF-Handstrukturen Aequorin, das eine Konformationsänderung führt zu Oxidation von Coelenterazin, die Energie strahlungslos auf die GFP überläuft. Diese Energieübertragung führt zur Freisetzung von grünem Licht (λ = 509 nm) von GFP anstelle von blauem Licht von Aequorin. Die Fusion von GFP und Aequorin verleiht auch höhere Proteinstabilität hilft das Fusionsprotein produzieren Licht 19-65 mal heller als allein 4 Aequorin. Unter Verwendung eines Biolumineszenz-Ansatz im Gehirn erweitert die aktuelle experimentelle Anwendung von Calcium-Bildgebung sowohl in Bezug auf die Dauer der kontinuierlichen Aufzeichnung und die Anzahl der Strukturen innerhalb des Gehirns, die aufgezeichnet werden können. Im Großen und Ganzen im Rahmen der bisherigen Arbeit es bedeutet, dass sowohl globale als auch eine größereVielzahl von regionalisierten "Aktivität" des Gehirns (über den Proxy von Calciumtransienten) überwacht werden. Noch wichtiger Aktivität kann mehr überwacht werden, in einem Echtzeit und kontinuierlicher Weise, die ohne weiteres eignet sich für die Ausübung der ein vollständiges Verständnis der Basisfunktion im Gehirn.
In den letzten Jahren haben unser Labor und andere transgene Fliegen, die das GFP-Aequorin unter der Steuerung des binären Expressionssystem (GAL4 / UAS-GFP-Aequorin) 5,6 exprimieren entwickelt. Wir GFP-Aequorin-Biolumineszenz durch natürliche Reize wie Duft 7,8 sowie suchten Zellkomponenten Modulieren Ca 2+ -Aktivität in den Pilzkörpern folgenden Acetylcholinrezeptorstimulation durch direkte nikotinischen Anwendung 9 erzeugte Datensatz Aktivität verwendet. Darüber hinaus haben wir auch verwendet GFP-Aequorin, um eine Reihe von experimentellen Fragen, die nicht in der Lage gewesen zu bisher angegangen werden, wie Langzeit-AdresseBildgebung der spontanen Calciumtransienten und Visualisierung von tieferen Hirnstrukturen 10. In jüngerer Zeit haben wir die GAL4 / UAS-System verwendet, um die Säuger-ATP-Rezeptor P2X 2 11 einen Kationenkanal, in den Projektionsneuronen (PNs) auszudrücken und verwendet die LexA System GFP-Aequorin in den Pilzkörpern exprimieren (MB247-LexA 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a freundlicher Genehmigung von B. Pfeiffer, Janelia Bauernhof, USA). Dies ermöglichte es uns, die PNs durch Anwendung von ATP, das wiederum aktiviert den Pilzkörpern (a nachgeschalteten Ziel des PNs) zu aktivieren, die Nachahmung natürlicher Bedingungen, wie als Antwort auf eine Geruchsreiz. Insgesamt ist diese Technik kombiniert P2X 2 und GFP-Aequorin erweitert die experimentellen Möglichkeiten. Im Großen und Ganzen bietet es die Möglichkeit, die Aktivitätsmuster im Gehirn besser zu verstehen, die Einleitung neuer Studien darüber, wie verschiedene Reize und Störungen können die basalen Strukturierung der Aktivitäten zu ändern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das kürzlich entwickelte Biolumineszenz basierende GFP-Aequorin hier vorgestellte Ansatz ermöglicht in vivo funktionelle Aufnahme von Ca 2+ -Aktivität in verschiedenen Neuronen sowie wenn gewünscht, mit anderen Arten von Zellen, wie zum Beispiel Nierensternzellen nach Cabrero et al. 2013 5.
Modifikationen, Fehlersuche, zusätzliche Komponenten und kritischen Schritte
Drosophila…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Riferimenti
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