In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina
Summary
Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.
Abstract
Funcional em imagiologia in vivo tornou-se uma abordagem poderosa para o estudo da fisiologia e função de células e estruturas de interesse cerebrais. Recentemente, um novo método de Ca 2+ -Imaging utilizando o repórter GFP-aequorina bioluminescente (GA) foi desenvolvido. Esta nova técnica baseia-se na fusão dos genes GFP e aequorina, produzindo uma molécula capaz de ligação de cálcio e – com a adição de celenterazina seu cofactor – emissor de luz brilhante que pode ser monitorizado através de um colector de fotões. As linhas transgénicas que transportam o gene de GFP-aequorina foram gerados para ambos os ratos e de Drosophila. Em Drosophila, o gene GFP-aequorina foi colocado sob o controlo do sistema de expressão binário de GAL4 / UAS permite a expressão específica e de imagem no interior do cérebro. Este método tem sido mostrado subsequentemente que ser capaz de detectar tanto para dentro de Ca2 + e Ca 2+ -transients -released interiores de lojas. Mais importante que permite uma maior duração em gravação contínua, imagens em maiores profundidades no interior do cérebro, e gravar em altas resoluções temporais (até 8,3 ms). Aqui nós apresentamos o método básico para usar a imagem de bioluminescência para registrar e analisar Ca 2+ -Atividade dentro dos corpos de cogumelo, uma estrutura central para o aprendizado e memória no cérebro da mosca.
Introduction
A padronização e função de atividade dentro do cérebro e suas estruturas discretas fundamentais são há muito tempo uma área de intenso estudo no campo da neurociência. Talvez algumas das primeiras abordagens de sucesso utilizadas para resolver este problema foram mensuração fisiológica direta da mudança na atividade elétrica – métodos no entanto alternativas que permitem imagens ao vivo de alterações nas concentrações de tensão, de pH ou de cálcio (como proxy para a atividade) trouxe recursos adicionais para o estudo da actividade neuronal 1. Técnicas de imagem transportar uma grande variedade de vantagens, tais como a redução da capacidade de invasão e a capacidade de monitorar a atividade dentro de estruturas inteiras do cérebro. Além disso, em animais com genética tratáveis, incluindo a mosca da fruta Drosophila, desenvolvimento de indicadores de cálcio geneticamente codificados, como cameleon, GCaMPs e outros 1 permitiram que os pesquisadores para monitorar neurônios individuais, populações neuronais e do cérebro inteiroestruturas. Enquanto métodos de imagem de cálcio fluorescentes tradicionais mais usando GCaMPs (GFP fundido a calmodulina) ou FRET (PCP e YFP fundido a calmodulina) provaram ser técnicas úteis que fornecem boa resolução espacial e temporal, o processo subjacente de excitação luz gera algumas limitações em seu experimental aplicações. Devido à natureza da luz de excitação, a autofluorescência, foto-branqueamento, e fototoxicidade é inevitavelmente produzido, o que, por conseguinte, limita a profundidade das estruturas que podem ser visualizados, a duração de gravação assim como a continuidade de gravação em tempo real. Em outras palavras, as gravações deve frequentemente ser executada de forma intermitente a fim de evitar estes efeitos secundários indesejáveis.
Devido a estes desafios, foram desenvolvidos métodos alternativos adicionais de imagiologia de cálcio. Um dos métodos mais promissores é imagiologia bioluminescente, que depende da luz produzida por meio de uma reacção enzimática após ligação ao cálcio. Bioluminescent de imagem não requer luz de excitação e, consequentemente, não experimenta as mesmas dificuldades que imaging cálcio convencional. O repórter bioluminescente Aequorina – isolado de Aequorea victoria, o mesmo Jellyfish a partir do qual GFP também foi isolated- liga de cálcio através dos seus três estruturas mão EF e sofre uma mudança conformacional, levando a oxidação do seu coelenterazina cofator ea liberação de luz azul (λ = 469 nm) de 2,3. A Aequorina tem uma afinidade muito baixa para o cálcio (K d = 10 uM) que o torna ideal para monitorizar transientes de cálcio porque produz muito pouco barulho de fundo e não interfere com o sistema de tamponamento de cálcio intracelular 4. Embora aequorina tenha sido previamente utilizado para monitorizar o processo de indução neural no ovo de Xenopus 5 a luz produzida é muito fraca a ser usado para imagiologia de actividade neuronal em tempo real. Em um esforço para enfrentar este desafio, Philippe Br &# 251; deixe e seus colegas do Instituto Pasteur criou uma construção genética de fusão GFP e a aequorina genes, imitando o estado nativo dentro da água-viva 4. Este produto génico de fusão se liga a cálcio de novo através das três estruturas de mão EF de aequorina, que sofre uma alteração conformacional que conduz à oxidação da coelenterazina, o que transfere energia não radiativamente para o GFP. Esta transferência de energia resulta na liberação de luz verde (λ = 509 nm) da GFP, em vez de luz azul do aequorin. A fusão de GFP e aequorin também confere maior estabilidade da proteína ajudando a proteína de fusão produzir luz de 19 a 65 vezes mais brilhante do que a aequorina sozinha 4. Usando uma abordagem bioluminescente dentro do cérebro expande a aplicação experimental corrente de imagiologia de cálcio, tanto em termos de duração de gravação contínua e o número de estruturas dentro do cérebro que pode ser gravada. Em termos gerais no contexto do trabalho anterior, isso significa que ambos global e uma maiorvariedade de "actividade" regionalizada do cérebro pode ser monitorizada (por meio do proxy de transientes de cálcio). Mais importante actividade pode ser monitorizada por mais tempo, em tempo real e uma base contínua, que se presta facilmente à busca de uma compreensão completa da função basal no cérebro.
Nos últimos anos, o nosso laboratório e outros desenvolveram moscas transgénicas que expressam a GFP-aequorina sob o controlo do sistema de expressão binário (GAL4 / UAS-GFP-aequorina) 5,6. Usámos GFP-aequorina bioluminescência para a actividade ficha produzido por estímulos naturais, tais como aroma de 7,8, bem como os componentes celulares estudadas moduladores Ca2 + -Atividade nos corpos de cogumelo seguintes estimulação do receptor de acetilcolina nicotínico por aplicação directa 9. Além disso, temos também usado GFP-aequorina para abordar uma série de questões experimentais que não puderam ser abordadas anteriormente, como a longo prazoimagens de transientes de cálcio espontâneas e visualização de estruturas mais profundas do cérebro 10. Mais recentemente, temos utilizado o sistema / UAS GAL4 para expressar o receptor de mamífero ATP P2X 2 11 um canal de cátions, nos neurônios de projeção (PNs) e utilizado o sistema de LexA para expressar GFP-aequorina nos corpos de cogumelo (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (a cortesia de B. Pfeiffer, Janelia Quinta, EUA). Isto permitiu-nos para ativar as PNs através da aplicação de ATP, que por sua vez ativa os corpos de cogumelo (um alvo a jusante da PNs), imitando condições mais naturais, como a resposta a um estímulo odor. No geral, esta técnica que combina P2X 2 e GFP-aequorina amplia as possibilidades experimentais. Em termos gerais, oferece a oportunidade de compreender melhor os padrões de atividade no cérebro, dando início a novos estudos sobre como os diferentes estímulos e perturbações podem alterar o padrão basal de atividade.
Protocol
Representative Results
Discussion
A abordagem de GFP-aequorina à base bioluminescente recentemente desenvolvido aqui apresentada permite a gravação funcional in vivo de Ca 2+ -Atividade em diferentes neurónios, assim como, se desejado, em outro tipo de células, tais como células estreladas rim como relatado em Cabrero et ai. de 2013 5.
Modificações, resolução de problemas, componentes adicionais e etapas críticas
<p class="jove_content"…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
Riferimenti
- Martin, J.-R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose? J Neurogenet. 22(3), 285-307, (2008).
- Shimomura, O., & Johnson, F.H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75(6) 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F.H., & Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62(1), 1-8, (1963).
- Baubet, V. et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97(13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S.A., Dow, J.A.T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280(1757), 2012-2943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S.E., Daguzan, C., Moreau, M., & Miller, A.L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113(19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J.-R., Rogers, K.L., Chagneau, C., & Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2(3), e275, (2007).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., & Martin, J.-R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213(24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M.S., Stinnakre, J., Réal, E., & Martin, J.-R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105, (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., & Martin, J.-R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2(2), 0054-0068, (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M.S., & Martin, J.-R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833(7), 1632-1640, (2013).
- Lima, S.Q., & Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121(1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., & Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14(5), 373-378, (1993).
- Berridge, M.J., Bootman, M.D., & Roderick, H.L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4(7), 517-529, (2003).
- Fiala, A., & Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003(174), PL6, (2003).
- Wang, J.W., Wong, A.M., Flores, J., Vosshall, L.B., & Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112(2), 271-282, (2003).
- Wilson, R.I., Turner, G.C., & Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303(5656), 366-370, (2004).
