心外膜の伸長文化検定と<em> ex vivoで</em>心外膜由来の細胞移動の評価
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
心外膜細胞株の単層心臓、心筋細胞の増殖を刺激するパラクリン因子を提供し、直接開発や病気の際に心臓血管前駆細胞を貢献しています。多くの要因は、心外膜由来細胞（EPDC）の動員に関与してきたが、彼らのその後の移行および分化を支配するメカニズムはよく理解されていません。ここでは、EPDC運動性および分化を研究するための戦略をin vitroで提示し、ex vivoで 。まず、我々はマウス胎児心臓から成長培養によって一次心外膜細胞を得る方法を説明します。我々はまた、器官培養系において標識EPDCの三次元移動を評価するための詳細なプロトコルを導入します。我々は、心外膜でミオカルディン関連転写因子の遺伝子欠失がEPDC移動を減衰させるこれらの技術を使用して証拠を提供します。このアプローチは、EPDCの候補修飾因子を評価するためのプラットフォームとして機能します生物学とは、心臓の修復に有用であるかもしれないEPDC動員の新規な調節因子を同定するための遺伝的または化学的なスクリーニングを開発するために使用することができます。
Introduction
心外膜は、中皮細胞の単層であるラインハートと影響心臓の発達、成熟および修理。パラクリン信号の高度に調整して交換を通じて、心筋および心外膜の間の密接な対話が心の成長と非筋細胞、心臓系統1の形成に不可欠です。心外膜由来細胞（EPDC）は上皮-間葉転換（EMT）2を介して心外膜細胞のサブセットから出て、心外膜下空間とその下の心筋に侵入し、主に冠動脈の血管壁細胞と心臓線維芽細胞に分化、およびへより少ない程度、内皮細胞および心筋3-9。
心外膜EMTとEPDCの侵入を調節するメカニズムは、分泌リガンド10-13、細胞表面受容体と接着分子14,15、のRegu含む様々な分子の協調作用に起因するとされています頂端-基底極性16,17のレータ、低分子量GTPase 18,19、および転写は2,20,21因子 。 EPDCの移行の分子エフェクターの多くが定義されているが、胚にEPDC動員を刺激する生理学的信号をよりよく理解することは、改善された心臓修復のために成人にこのプロセスを操作するための戦略の開発を加速することができます。
EPDC動員の新規調節因子を同定することを目的とした研究は、この細胞集団の精製または個々の心外膜細胞の移動を追跡するに依存しています。一つまたはWT1、Tcf21、Tbx18、および/ またはAldh1a2含むマーカー遺伝子の組み合わせは、一般に胎児の心外膜1を識別するために使用されます。心外膜マーカーの発現は、心臓の開発の過程で衰えると心外膜細胞がtransdifを受ける際にしばしば失われるしかし、EPDCを移行追跡するためにこれらのマーカーの使用は最適ではありません間葉系細胞へのferentiation。
Cre / loxPシステムのアプリケーションでは、系統追跡記者と連携して、恒久的に心臓の開発中に心外膜とその子孫を標識し、大人7,22,23における虚血性損傷後に有用でした。いくつかの心外膜制限のCre株が生成されていると広くEPDCを標識し、条件付き遺伝子欠失戦略1のために使用されます。これらの研究は、様々な心外膜の系統の特性評価、およびEPDC運動性および分化の重要なメディエーターの同定につながっています。しかし、蓄積証拠も心外膜は、前駆細胞4,24,25の異種集団であることを示唆しています。このように、心外膜細胞のサブセットのみが与えられたCreドライバを使用して標的化することになります。
かかわらずのCre特異性の全体心外膜を標識するためには、研究室の数が伸長CULを利用してきましたチャーシステムまたはエキソビボ器官培養法を忠実に遺伝的系統マーカー26-28の発現に依存することなく、心外膜細胞を単離するか、標識します。 ex vivoでの移行研究のために、胚の心臓は心外膜EMTの前にし、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現アデノウイルス（広告/ GFP）9,18を添加した培地で培養分離されています。このアプローチは、効率的な全体心外膜の標識ではなく、Cre介在組換えによって細胞のサブセットを可能にします。ハート培養物は、その後EPDC 28,29の動員を刺激することがEMTの既知の誘導物質にさらされている。 エクスビボおよびin vivoでの分析EPDCの移行を駆動する詳細なメカニズムを探索するために特に有用なアプローチであるin vitroの心外膜外植片培養物によって補完されています。
ここでは、epicardiのインビトロ研究のための一次心外膜細胞を単離するための方法を記載しますアルEMT、ならびにEPDC運動のex vivo分析のための器官培養系。我々は最近、遺伝的にEPDC 9のアクチンベースの移行を操作するために軸をシグナリングミオカルディン関連転写因子（MRTF）/血清応答因子（SRF）を調節することによって、この方法の有用性と堅牢性を実証しました。我々の知見はEPDC移動を規制するために必要な1つの信号経路を強調しながら、これらの方法はまとめEPDC遊走および分化を調整するメカニズムを解明するのに適しています。また、外植片およびエクスビボ培養系は、心臓再生における治療用途にEPDC動員の新規調節因子を同定するために、機能画面で実施することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、伸長してプライマリ心外膜細胞を分離し、ex vivoでの心臓培養物中のEPDCの移動を追跡するための詳細な方法を概説します。伸長の文化のために、心外膜枯渇心を除去するための適切な時間は、実験間で多少異なります。一晩のインキュベーションの後、外植片の定期的なモニタリングが心外膜伸長の程度を測定すると、線維芽細胞が出現する前に心を抽出することをお勧め?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMSは、国立衛生研究所（NIH）からの助成金[助成金番号R01HL120919]によってサポートされていました。米国心臓協会（American Heart Association）[助成金番号10SDG4350046]; NIH [助成金番号UL1 TR000042]からロチェスター大学CTSAの賞を受賞。そしてAAB CVRIからスタートアップ資金。 MATは、ハワード・ヒューズ医療研究所メッド・イントゥ・グラッドイニシアティブから医学と歯学のロチェスター校の大学への助成金によって部分的にサポートされていました。 NIHからと制度ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞[助成金番号GM068411]。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
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