评估抗癌药物的特异性<em>体外</em

Summary

该协议的目的是评估使用同时含有肿瘤和非肿瘤细胞混合培养抗癌药物在体外的特异性。

Abstract

一种用于在使用同时含有肿瘤和非肿瘤细胞培养物的体外评估的抗癌药物特异性过程证明。的关键要素是使用双探针数字PCR测定和肿瘤细胞的比例的后续计算定量测定相对肿瘤特异性遗传改变的一个普遍序列。该试验是在含有和已建立的线路的肿瘤细胞的培养进行了掺入-在非肿瘤细胞。混合培养用各种浓度的试验药物进行处理。在处理后，DNA直接从在利用简单和廉价的方法的96孔板孔中的存活粘合剂细胞制备，并进行双探针数字PCR分析，用于测量肿瘤特异性遗传改变和参考普遍序列。在本示范中，NF1基因的杂合缺失用作肿瘤特异性遗传改变和一个RPP30基因作为参考基因。使用比率NF1 / RPP30，肿瘤细胞的比例计算。因为肿瘤细胞的比例的剂量依赖性变化提供了该药物的特异性的体外指示，这种遗传和基于细胞的体外测定法将可能有在药物发现的应用潜力。此外，个性化癌症护理，这genetic-和基于细胞的工具可以有助于通过使用个别肿瘤的原代培养物测试功效和候选药物特异性的手段优化辅助化疗。

Introduction

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools¹. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.

Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines². More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing^2-4.

An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.

This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

Protocol

1.准备混合文化同时含有肿瘤细胞和非肿瘤细胞使用的肿瘤细胞从已建立的细胞系MPNST S462 5。使用成纤维细胞作为非肿瘤细胞6,7- 培养既肿瘤细胞和在标准DMEM培养基含有10％胎牛血清的成纤维细胞（BSA），3 2mM谷氨酰胺，0.1毫摩尔2-巯基乙醇，500U / ml青霉素，500微克/毫升链霉素和1mM丙酮酸钠，37℃和5％的CO 2 5-7在亚汇合时，收获用0.05％胰蛋白酶的细胞，并使用血细胞计数器计数。 混合400肿瘤细胞和1600非肿瘤细胞一起在96孔培养板的每个孔在0.2ml培养基。考虑肿瘤细胞在5天治疗期的增长更快，肿瘤细胞的初始比例被设置为25％。设置4个重复每个药物浓度。孵育细胞在37℃和5％的CO 2 O / N。 2.德鲁摹治疗使用尼罗替尼作为测试药物。制备在DMSO 0，2，4和20mM尼洛的储备溶液。通过200倍的5ml DMEM培养基稀释他们每个人的，给人为0，10，20和100微米6.7 2倍浓缩的药物溶液。 从每个删除0.1毫升中井和加入0.1毫升含有培养基的药物。终浓度是0，5，10和50微米。继续温育在含药物培养基中的细胞5天。 在治疗结束时，检查用相位差显微镜的附着的细胞，并拍照。吸出介质走，用0.2ml的PBS洗一次存活粘合剂细胞。 3.准备的DNA数字PCR 裂解细胞使用的HotShot 8。 加入50μl碱裂解溶液（25mM的氢氧化钠，0.2毫摩尔EDTA）到每个孔中。用铝箔密封井。孵育在95℃的板在烘箱中或在加热板上30分钟。查了下，MICR的Oscope以确保没有更多的完整的细胞保持在孔的表面上。万一细胞并没有完全溶解，增加加热时间或者添加洗涤剂。在-20℃冷冻过一次，还有c可增强细胞的破坏。 加入50μl中和液（40毫摩尔Tris-HCl，pH值4.0）至各孔中。传输所有裂解物成PCR板和干在PCR循环仪中的U形形式的井在95℃下进行10至30分钟。重构用20微升蒸馏水裂解物。 使用下拉式透析9淡化使用膜过滤器与平均孔径0.025微米。 浮在蒸馏水过滤器在一个12孔板的孔中有光泽的一面朝上。湿过滤器5分钟。注意避免过滤器和水之间产生气泡。 吸管从步骤3.1.4各样品的重组溶胞产物小心到每个滤波器的4个区域的。覆盖板和透析30至60分钟。 吸走水过滤器没有下过翻转过滤器，也没有扰乱滴。 传送裂解物滴到一个新的PCR的板的孔中。干燥通过加热使DNA的液滴在95℃下进行10至30分钟，在PCR循环仪中。重构于10μl水中的溶胞产物。 4.数字PCR 解冻冷冻组分如DNA，缓冲液和在RT测定混合物，降速10秒在任何可利用离心机的最大的力（例如，VWR微型离心机），然后保持他们在冰上。 准备包含除DNA（ 表1）所有组件的主混合物中。考虑死体积并计算比所需量多大约10％的主混合物中。 注意：使用在市售试剂盒中使用的引物和探针。 涡流的主混合物，降速10秒在任何可利用离心机的最大的力（例如，VWR微型离心机）并分配15微升到每个96 PCR板的井。添加所有裂解液（包含DNA）每个样品包含主混合井。转移20微升每个反应混合物的成孔上在RT盒的样本面。 分配70微升液滴生成的油的成每个孔上的卡盒的油面。与垫圈关闭墨盒和整个设置放入一个液滴发生器。启动液滴产生。 转移40微升液滴溶液到96孔PCR平板的孔中。密封用薄片的板和板放置到PCR仪。设定在105℃的盖温度，并在2℃/秒斜坡率。 表2中的设置进行PCR后的PCR，该板块转移到液滴的读者开始阅读。可替代地，存储在4℃的板长达24小时。 5.计算肿瘤细胞的比例加载数字PCR数据，并执行自动analys是。 手动检查的正和负的液滴的一维和二维分布控制各测定的结果，并确保它们很好地分离和阈系是在正确的位置上。排除的结果不符合标准，例如，正和负的液滴没有明确分开，从进一步的分析。由此产生比NF1 / RPP30复制到Excel表格中。 计算肿瘤细胞作为比重：2×（1- NF1 / RPP30）。 肿瘤细胞的比例6.剂量依赖性变化每种药物浓度，计算从4个重复的平均值和标准偏差。绘制的手段和打击与毒品浓度的标准偏差。

Representative Results

使用组合的HotShot /落透析是足以令人满意的数字PCR（ 图1B）制备的DNA的质量。为2000的成纤维细胞，约得到3000±500正液滴，对应于预期4000份（在一个小区中一式两份）的75％。在这项研究中，肿瘤细胞从已建立的线路MPNST S462这是众所周知的具有NF1基因5的杂合缺失。这50％的基因剂量减少显然由双数字PCR检测（ 图1B）进行检测。与此相反，在成纤维细胞，测定该基因的两个拷贝。肿瘤和非肿瘤细胞之间的这种遗传差异使得在混合培养物的肿瘤细胞（ 图2）的比例的计算。通过测量NF1的相对基因剂量RPP30，在混合培养的肿瘤细胞的比例可以被确定在每一药物浓度（ 图3）。 图1. 数字PCR（A）说明的原则。 （B）双探针检测显示减少了肿瘤细胞MPNST S462的目标（NF1）基因相对于参考（RPP30）基因的数量。 请点击此处查看该图的放大版本。 图2 肿瘤细胞的计算比例。肿瘤细胞和非肿瘤细胞以不同比例混合，并接种到96-板的各孔中。附件O / N，将细胞裂解机智后ħ的HotShot /掉落透析和脱盐，溶菌物进行这给了NF1 / RPP30的比例数字PCR。在此基础上的比例，肿瘤细胞在每孔的比例来计算。平均并计算肿瘤细胞的比例的标准偏差从4个重复在每个设置的比例。肿瘤细胞（Y轴）的计算比例分别为暗算的设立比例（X轴）。 请点击此处查看该图的放大版本。 图3. 肿瘤细胞比例的剂量依赖性变化。（A）剂量依赖性可见至关重要的细胞减少。 （B）中的肿瘤细胞的比例（平均为4次重复的标准差）从计算出的 NF1的比率： – 10μMRPP30，在0范围减小。在最高剂量50微米，一些重要的细胞被留下，很可能是由于毒性作用于所有细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。 从非肿瘤细胞的肿瘤细胞（A）的存活力和/或总细胞的增殖如图4 分离反应可使用常规的测定法来测量;可使用在本研究中表现出的程序来确定肿瘤细胞的比例。使用两个参数（B）中，混合培养对药物的总细胞的反应可以分为肿瘤细胞和非肿瘤细胞的应答的响应。.COM /文件/ ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 1反应 2×ddPCR超混合液 12 分析组合的NF1 1.2 测定混合物的RPP30 1.2 HaeIII 0.6 小计 15 混合大师脱氧核糖核酸 9 总 24 最终的PCR混合物 表1设置双ddPCR反应 步 行动 温度 时间 周期 1 POLYM清除激活 95℃ 10分钟 1 2 DNA变性 94℃ 30秒 40 3 退火/ exetension 60℃ 1分钟 4 聚合酶失活 98℃ 10分钟 1 五保持（可选） 4℃ 表2 PCR仪设置

Discussion

在用于体外评估药物特异性此genetic-和基于细胞的工具中的关键步骤是使用一个或多个肿瘤特异性的遗传特征的肿瘤细胞的比例的测定。与传统的表型特征^7，遗传特性是特定的，稳定的和容易量化。例如，肿瘤特异性突变或拷贝数变异只存在于肿瘤细胞中，但不是在非肿瘤细胞。这样的遗传柱头能够可靠地和精确地定量，例如，使用数字PCR如本研究。

对于数字PCR，DNA的高纯度不是必要的。然而，脱盐并除去抑制分子是必要的，这可以通过使用合适的滤光器的下拉式透析来实现。将合并的裂解和下拉式透析是简单，快速，不需要特殊的工具，因此，可以在任何标准的实验室中进行。如果细胞不布雷亚ķ良好，另外的处理可以被认为是，如冷冻细胞在-20℃，加入洗涤剂和/或使用蛋白酶。

在本研究中，NF1基因的杂合缺失用作定量肿瘤特异性特征。同样地，也可以使用其他的基因或基因座的缺失。此外，突变也可用于定量肿瘤细胞。在这种情况下，对于突变体数字PCR测定和正常等位基因需要被广泛验证，以确保其为每个特异性。

肿瘤细胞的剂量依赖性比例为药物 – 特异性或选择性的指示。此外，它也使从混合培养的总细胞对药物（ 图4）的响应的肿瘤细胞中提取的响应。此萃取策略提供了在使用原代培养物的技术问题的解决方案（其中包含肿瘤和无正肿瘤细胞）进行药物测试。

基于细胞在本研究证明因此可能具有应用潜力的体外工具genetic-和（1）在药物发现，其中它提供了用于评估药物特异性或选择性的体外和一平台（2）个性化癌症护理它使测试药物在小学文化，因此可以辅助化疗⁴有助于药物的选择。此外，可以使用此工具来研究药物的药理作用机制，因为某些遗传改变或多个基因改变可以在药物治疗过程中应遵循。

在使用个别化原代培养物的一个困难是缺乏对肿瘤细胞的量化的通用遗传特征。但是，随着今天的全基因组测序提前，最频繁改变的基因和区域是已知的常见的肿瘤。例如，其中头部和颈部肿瘤，71％，23％和22％具有在TP53，FAT1突变和CDKN2A基因，60％，34％和26％具有在CDKN2A，STK11和PTEN，分别为¹⁰的基因区域缺失。因此，通过靶向测序和/或数字PCR方法筛选5至10个这样的基因或/和地区将有可能确定哪些可用于肿瘤细胞中的衍生初级培养定量的一种或多种遗传改变。另一个限制是用于建立原代培养物的切除肿瘤的量往往不足。

尽管有利特征和genetic-的有前途的应用潜力和基于细胞的体外工具，其限制，应牢记及其体外性质应该强调。例如，对肿瘤细胞的差动作用或细胞毒性药物的可能，而由于在细胞类型差异（成纤维细胞与雪旺氏细胞）或它们不同来源（来自不同个体）。在肿瘤细胞上比在非肿瘤细胞的药物中较强的作用也由一个事实，即前者增长比后者快进行说明。最重要的是，细胞在体外行为不同比在人体中的细胞，因此， 在体外评估结果经常没有或只是部分地反映真实的临床情况。因此，功效，毒性和对培养的细胞获得的药物特异性相当的生物标志物的性质，但不具有抗生素临床前测量效力的可靠性。然而，从细胞系混合培养和/或初级培养移动是在评估在体外的药物作用和特异性/选择性前进了一步。具有广泛的努力， 在体外条件可以发现这使得与患者实际响应，至少在某些药物在体外数据的合理相关性。

Materials

membrane filter of 25 mm diameter	Merk-Millipore	VSWP 02500	for drop-dialysis
ddPCR assay for NF1	BioRad	dHsaCP1000177	FAM-labelled
ddPCR assay for RPP30	BioRad	dHsaCP2500350	HEX-labelled
QX200	BioRad	186-4001	the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200
Droplet oil	BioRad	186-3005
Cartriges	BioRad	186-3004
Gaskets	BioRad	186-3009
Cartrige holder	BioRad	186-3051
pierceble foil	BioRad	181-4040