Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi<em> İn Vitro</em

Summary

Bu protokolün amacı, tümör ve non-tümör hem hücreleri içeren karışık kültürleri kullanılarak in vitro antikanser ilaçların özgüllüğünü değerlendirmektir.

Abstract

Tümör olmayan Tümör hücreleri ihtiva eden kültürler kullanılarak in vitro anti-kanser ilaç özgüllüğünü belirlemek için kullanılan prosedür gösterilmektedir. Anahtar elemanı çift sonda, dijital PCR deneyi ve tümör hücrelerinin oranı daha sonra hesaplama kullanılarak evrensel sekansına ilişkin olarak, bir tümör-spesifik genetik değişiklik kantitatif belirlenmesidir. Deney Tümör kurulu bir hattın hücreleri ihtiva eden bir kültürün üzerinde gerçekleştirilmektedir katkılı olmayan tümör hücreleri. karışık kültür çeşitli konsantrasyonlarda test ilacı ile muamele edilmektedir. muameleden sonra, DNA, bir basit ve ucuz bir yöntemi kullanarak 96-çukurlu tablalara, hayatta yapışkan hücreler tarafından doğrudan hazırlanır ve tümöre spesifik genetik değişiklik ve bir referans genel sekansı ölçmek için bir çift sonda, dijital PCR analizine tabi . Bu gösteri NF1 geninin heterozigot silinmesi tümör spesifik genetik değişiklik olarak kullanılır veReferans gen gibi bir RPP30 geni. Oranı NF1 / RPP30 ile tümör hücrelerinin oranı hesaplanmıştır. Tümör hücrelerinin oranının doza bağımlı bir değişiklik ilacın özgüllüğü için bir in vitro gösterge sağlar çünkü bu, genetik ve hücre bazlı in vitro deney muhtemelen ilaç keşfi uygulama potansiyeline sahip olacaktır. Bundan başka, kişiselleştirilmiş kanserine bakımı için, bu Genetik-ve hücre tabanlı bir araç tek tek tümörler birincil kültürleri kullanılarak etkisini test etmek ve aday ilaçların spesifite ile adjuvan kemoterapi optimize katkıda bulunabilir.

Introduction

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools¹. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.

Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines². More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing^2-4.

An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.

This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

Protocol

1. Malzemeler Kültür tümör hücreleri ve non-tümör hücreleri hem de içeren hazırlanması Kurulu hücre çizgisi MPNST S462 5 tümör hücreleri kullanır. Non-tümör hücreleri 6,7 olarak fibroblastlar kullanın Kültür, her iki tümör hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, standart DMEM ortamı içinde fibroblastlar (BSA), 3 mM glutamin, 0.1 mM 2-merkaptoetanol, 500 U / ml penisilin, 500 ug / ml streptomisin ve 1 mM sodyum piruvat, 37 ° C'de ve% 5 CO Şubat 05-07. alt izdiham,% 0.05 tripsin ile hücreler hasat ve hemasitometre kullanarak onları saymak. 0.2 ml ortam içinde 96 çukurlu bir kültür plakasının her bir oyuğuna birlikte 400 tümör hücreleri ve 1.600 non-tümör hücreleri karıştırın. 5 günlük tedavi süresi boyunca tümör hücrelerinin hızlı artışı göz önüne alındığında, tümör hücrelerinin başlangıç ​​oranı% 25 olarak belirlenmiştir. kurmak 4 her ilaç konsantrasyonu için çoğaltır. 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5 CO2 O / N. 2. Drug Tedavisi Test ilaç olarak nilotinibin kullanın. DMSO içinde, 0, 2, 4 ve 20 mM nilotinibin stok çözelti hazırlayın. 0, 10, 20 ve 100 uM 6.7 2 kat konsantre edilmiş ilaç çözeltileri vererek, 5 mi DMEM ortamında 200-kat, her biri seyreltilir. Her 0.1 mi orta de kaldırma ve orta ilacı içeren 0.1 ml ekleyin. nihai konsantrasyonlar 0, 5, 10 ve 50 uM bulunmaktadır. 5 gün boyunca ortam ihtiva eden bir ilaç hücrelerin inkübe edilmesi devam edin. Tedavinin sonunda, bir faz-kontrast mikroskop kullanılarak ekli hücreleri incelemek ve fotoğraf çekmek. Uzak orta aspire 0.2 ml PBS ile bir kez hayatta yapışkan hücreleri yıkayın. 3. Dijital PCR için DNA hazırlanması HotShot 8 kullanarak lyse hücreleri. her bir oyuğa 50 ul alkalin liziz çözeltisi (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA) ekleyin. folyo ile kuyu Seal. bir fırın içinde ya da 30 dakika için bir ısıtma plakası üzerinde 95 ° C'de inkübe plakası. Bir MICR altında edinOscope daha sağlam hücreler kuyu yüzeyinde kalan olduğundan emin olmak için. durumunda hücreler tamamen lyse ısıtma süresini artırmak veya deterjan eklemek vermedi. -20 ° seferde Freeze da hücrelerin kırma artırır C. Her kuyucuğa çözeltisi (40 mM Tris-HC, pH 4.0) nötralize 50 ul ekle. 10 ila 30 dakika süreyle 95 ° C de bir PCR döngü bir PCR plaka ve kuru U biçimli kuyular içine tüm lizatları aktarın. distile su 20 ul lizatları sulandırın. Bırak-Diyaliz 9 kullanarak Tuzu Çöz ortalama gözenek boyutu 0.025 mikron membran filtreleri kullanmak. 12-çukurlu bir levhanın kuyularında parlak tarafı yukarı gelecek şekilde damıtılmış su filtre Float. 5 dakika boyunca filtreyi ıslatın. filtre ve su arasındaki hava kabarcıklarını önlemek için dikkat edin. Pipet dikkatle filtre 4 alanların her birinde üzerine adım 3.1.4 her numunenin yeniden lizatları. plaka kapatın ve 30 ila 60 dakika boyunca diyaliz. Filtreyi üzerinde saygısız, ne de damla bozmadan filtrenin altında su emiciler. yeni bir PCR-plakanın gözleri içerisine lizat damla aktarın. Bir PCR döngü 10 ila 30 dakika 95 ° C'de ısıtılarak DNA damla kuru. 10 ul su içinde lizatları sulandırın. 4. Dijital PCR Bu DNA, tampon ve oda sıcaklığında tahlil karışımı olarak çözülme dondurulmuş parçalar, (örneğin, VWR Mini santrifüjü) mevcut herhangi bir santrifüjün yüksek kuvvette 10 saniye boyunca aşağı doğru döner ve daha sonra buz üzerinde tutun. DNA (Tablo 1) dışındaki tüm bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın. Ölü hacim düşünün ve gereken miktardan daha yaklaşık% 10 daha fazla ana karışımı hesaplayın. NOT: ticari kit kullanılan primerler ve problar kullanın. Vortex ana karışımı, (örneğin, VWR Mini santrifüj) herhangi bir kullanılabilir santrifüj maksimum kuvvette 10 saniye boyunca aşağı doğru dönmeye ve her 15 ul dağıtmak96 PCR plaka de. ana karışım ihtiva eden çukurlara, her numunenin (DNA içeren) tüm lizat ekleyin. Aktarım oda sıcaklığında bir kartuş örnek tarafında iyi olarak her bir reaksiyon karışımının, 20 ul. Bir kartuşun yağ tarafındaki her bir kuyunun içine damla üreteci yağı 70 ul koyun. conta ile kartuşu kapatın ve bir damlacık jeneratör içine bütün ayar yerleştirin. Damlacık oluşturma başlatın. 96-çukurlu bir PCR plaka oyuklarına Aktarım 40 ul damla çözeltisi. Bir folyo ile plaka Seal ve PCR cycler içine plaka yerleştirin. 105 ° C'de kapak sıcaklığını ayarlamak ve 2 ° C / sn hızı rampa. Tablo 2'deki ayarları kullanarak PCR yürütmek. PCR, bir damlacık okuyucu plaka transfer ve okumaya başlayın sonra. Alternatif olarak, en fazla 24 saat boyunca 4 ° C 'de plaka saklayın. 5. Tümör Hücrelerinin Oranı Hesaplama Dijital PCR verileri yüklemek ve otomatik analys gerçekleştirmekolduğunu. elle pozitif ve negatif damlacıkların tek boyutlu ve 2 boyutlu dağılımını inceleyerek her testin sonuçlarını kontrol ve onlar iyi ayrılır ve eşik çizgileri doğru pozisyonlarda vardı emin olun. Sonuçlar, örneğin kriterlere uymayan dışlamak, daha fazla analiz olumlu ve olumsuz damlacıkların net bir ayrım. Bir excel sayfasında içine çıkan oran NF1 / RPP30 kopyalayın. 2 x (1-NF1 / RPP30): tümör hücrelerinin oranını hesaplar. Tümör hücrelerinin oranını 6. Doz-bağlı değişimini Her bir ilaç-konsantrasyonu için, 4 kez tekrarlanmış olan deneyin ortalama ve standart sapmayı hesaplayın. araç ve uyuşturucu konsantrasyonlarına karşı standart sapma çizilir.

Representative Results

DNA'nın kalitesi kombine HotShot / Bırak-Diyaliz tatmin edici dijital PCR (Şekil 1B) için yeterlidir kullanılarak hazırlanan. 2.000 fibroblastlar için, yaklaşık 3.000 ± 500 pozitif damlacıklar beklenen 4000 kopya (bir hücrede iki kopya)% 75 tekabül eden, elde edilmiştir. Bu çalışmada, tümör hücreleri NF1 geninin 5 bir heterozigot delesyon bilinen kurulu bir hat MPNST S462 geliyordu. Bu% 50 gen dozaj azaltılması açıkça çift dijital PCR yöntemi (Şekil 1B) tarafından tespit edildi. Buna karşılık, bu genin iki kopyası fibroblast ölçüldü. Tümör ve non-tümör hücreleri arasındaki bu genetik farklılık karışık kültürlerde tümör hücrelerinin (Şekil 2) oranının hesaplanmasını sağlar. RPP30 için NF1 göreceli gen dozajı ölçerek, karışık bir kültüründe tümör hücrelerinin oranı belirlenebilirHer bir ilaç-konsantrasyonunda (Şekil 3). Prensip Şekil 1. Dijital PCR. (A) resimde. (B) çift prob deneyi referans (RPP30) gen ile ilgili olarak tümör hücreleri MPNST S462 bir hedef (NF1) geni azaltılmış miktarda ortaya koymaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. Tümör Hücreleri hesaplanan oranı. Tümör hücreleri ve non-tümör hücreleri çeşitli oranlarda karıştırıldı ve 96 plakasının her oyuğuna tohumlandı. Ek O / N, hücreler lize edildi wit sonraH HotShot / Bırakma Diyaliz ve tuzdan arındırılmıştır lizatlar NF1 / RPP30 oranı verdi dijital PCR'ye tabi tutulmuştur. Bu oran Baz, her bir oyuk, tümör hücrelerinin oranı hesaplanmıştır. Ve ortalama 4 adet kurulum oranda tekrarlanmış olan tümör hücrelerinin oranı standart sapması hesaplandı. Tümör hücrelerinin (Y ekseni) hesaplanan oranlar kurulum oranlarda (X ekseni) karşı grafiğe geçirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil Tümör hücrelerinin oranını 3. Doz bağımlı değişiklikler (A). Doza bağımlı görünür yaşayan hücrelerin azalma. (B) tümör hücrelerinin oranı (ortalama 4 suretin standart sapma) hesaplanan NF1 oranı: – 10 uM RPP30, 0 ila azalmıştır. En yüksek doz 50 uM'de, birkaç önemli hücreler nedeniyle tüm hücrelere toksik etkisi, muhtemelen kalmıştı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. . Non-tümör hücreleri bu tümör hücrelerinin Şekil 4. Ayırma Yanıt (A) canlılık ve / veya toplam hücrelerin çoğalması geleneksel deneyler kullanılarak ölçülebilir; Tümör hücrelerinin oranı, bu çalışmada ortaya prosedür kullanılarak belirlenebilir. İki parametre kullanarak (B), bir ilaca, bir karışık kültür toplam hücrelerin tepki, tümör hücreleri ve tümör olmayan hücre tepkisinin karşılık ayrılabilir..com / files / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. 1 Tepki 2 x ddPCR Supermix 12 NF1 için tahlil karışımı 1.2 RPP30 için deney karışımı 1.2 Haelll 0.6 ara toplam 15 usta karışımı DNA 9 Toplam 24 Nihai PCR Karışımı Tablo 1 Çift ddPCR Reaksiyon Kurma Adım Aksiyon sıcaklık Zaman Bisikletler 1 Polymaktivasyon silmek 95 ° C 10 dakika 1 2 DNA denatürasyonu 94 ° C 30 sn 40 3 Tavlama / exetension 60 ° C 1 dakika 4 polimeraz devre dışı bırakma 98 ° C 10 dakika 1 5 Tut (isteğe bağlı) 4 ° C Tablo 2 PCR Cycler Ayarları

Discussion

In vitro ilaç özgüllük değerlendirmek için Genetik-ve hücre tabanlı bir araç anahtar aşama bir veya daha fazla tümör spesifik genetik özellikleri kullanılarak tümör hücrelerinin oranının belirlenmesidir. Geleneksel fenotipik özellikleri ⁷ aksine, genetik özellikler, özel bir kararlı ve ölçmek için kolaydır. Örneğin, bir tümör spesifik mutasyon ya da kopya sayısı varyasyonu non-tümör hücreleri, sadece tümör hücrelerinde değil, mevcut bulunmaktadır. Bu tür genetik leke hassas ve güvenilir şekilde bu çalışmada gösterildiği gibi, dijital, PCR kullanılarak, örneğin, belirlenebilir.

Dijital PCR için DNA yüksek saflıkta gerekli değildir. Ancak, tuz giderme ve inhibitör molekülünün çıkarılmasıyla, uygun bir filtre kullanılarak bir damla diyaliz ile elde edilebildiği gereklidir. Kombine parçalama ve açılan diyaliz, basit ve hızlı özel araçlar gerektirir ve bu nedenle herhangi bir standart laboratuarda yapılabilir. Hücreler brea yoksade k, ilave işlem örneğin, -20 ° C 'de hücreler dondurma deterjan eklenmesi ve / veya proteaz kullanılarak olarak kabul edilebilir.

Bu çalışmada, NF1 geninin heterozigot silinmesi ölçümü için tümöre özel bir özellik olarak kullanılır. Benzer şekilde, diğer genler ya da mahallerinin silmeler de kullanılabilir. Ayrıca, mutasyonlar ayrıca tümör hücrelerinin miktarının belirlenmesi için kullanılabilir. Böyle bir durumda, mutant için dijital PCR ve normal alleller yoğun bunların her biri için kendi özgüllüğü sağlamak için valide gerekmektedir.

Tümör hücrelerinin doza-bağımlı bir oranda ilaç spesifikliği veya seçicilik açısından bir gösterge sağlar. Ayrıca, aynı zamanda, bir ilaç (Şekil 4) karışık bir kültür toplam hücrelerin tepkisinden tümör hücrelerinin ekstre cevabı sağlar. Bu çıkarma stratejisi olmayan tümör ve her ikisini de içerir birincil kültürlerin kullanıldığı teknik sorun için bir çözüm sağlar (uyuşturucu testi için n-tümör hücreleri).

Genetik-ve bu nedenle uygulama potansiyeline sahip olabilir Bu çalışmada gösterilmiştir in vitro aracı hücre tabanlı (1) in vitro ilaç özgüllük veya seçicilik değerlendirilmesi ve bir platform sağlar ilaç keşif (2) kişiselleştirilmiş kanser bakımında nerede birincil kültürler test ilaçları sağlar ve sonuç olarak adjuvan kemoterapi ⁴ ilaç seçimi katkıda bulunabilir. Belirli genetik değişim ya da birden fazla genetik değişiklikler, ilaç-tedavi sırasında takip edilebilir Dahası, bir ilacın farmakolojik mekanizma, bu aracı kullanarak ele alınabilir.

bireyselleştirilmiş birincil kültürleri kullanılarak bir zorluk olmaması tümör hücrelerinin ölçümü için evrensel bir genetik özelliktir. Ancak, tam genom dizileme bugünün peşin ile, en sık değişmiş genler ve bölgeler ortak tümörler için bilinir. Örneğin, baş ve boyun arasındatümörler,% 71,% 23 ve% 22 TP53, FAT1 mutasyonu CDKN2A genleri ve% 60,% 34 ve% 26 CDKN2A, STK11 ve PTEN, sırasıyla ¹⁰ gen bölümlerde silmeler sahip bulunmaktadır. hedeflenen-dizisi ve / veya dijital PCR vasıtasıyla 5 ila 10 tür genleri ve / veya bölgeleri depolarının taranması bu nedenle muhtemelen türetilen primer kültür içinde, tümör hücrelerinin ölçümü için kullanılabilecek bir ya da daha fazla genetik değişiklik belirleyecektir. Başka bir sınırlama birincil kültürleri kurmak için rezeke tümörlerin çoğu zaman yetersiz miktarıdır.

Avantajlı özellikleri ve Genetik-umut verici uygulama potansiyeli ve hücre tabanlı in vitro aracı, kendi sınırlamaları göz önünde tutulmalıdır ve in vitro doğa vurgulanmalıdır rağmen. Örneğin, tümör hücreleri üzerinde, bir ilacın etkisinin karşılaştırılması ve sitotoksisite olabilir dolayı oldukça hücre tiplerinde farkı (Schwann hücrelerinin genel fibroblastlar) ya da onların(Farklı bireylerden) farklı kökenleri. non-tümör hücreleri üzerinde daha tümör hücreleri üzerinde bir ilacın daha güçlü etkisi, önceki ikinci daha hızlı büyür gerçeği ile açıklanabilir. En önemlisi, in vitro davranış hücreler, insan vücudundaki hücrelerin daha farklıdır ve dolayısıyla, in vitro değerlendirme sonuçları genellikle gerçek klinik durumu yansıtmıyor ya da sadece kısmen yok. Bu nedenle, etkinlik, sitotoksisite ve kültürlü hücreler için elde edilen ilaç özgüllüğü yerine biyomarker nitelikte ama antibiyotik klinik öncesi ölçülen etkinliği güvenilirliğini yoktur. Bununla birlikte, karma kültürlerin ve / veya primer kültürlerinde hücre hatları hareketli in vitro ilaç etkisi ve özgünlüğü / seçicilik değerlendirirken ileri bir adımdır. Geniş çaba ile, in vitro koşullarda, en azından bazı ilaçlar için hastanın gerçek tepkiler ile in vitro verileri makul bir ilişki sağlayan bulunabilir.

Materials

membrane filter of 25 mm diameter	Merk-Millipore	VSWP 02500	for drop-dialysis
ddPCR assay for NF1	BioRad	dHsaCP1000177	FAM-labelled
ddPCR assay for RPP30	BioRad	dHsaCP2500350	HEX-labelled
QX200	BioRad	186-4001	the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200
Droplet oil	BioRad	186-3005
Cartriges	BioRad	186-3004
Gaskets	BioRad	186-3009
Cartrige holder	BioRad	186-3051
pierceble foil	BioRad	181-4040