Оценка специфичности противоопухолевых препаратов<em> In Vitro</em

Summary

Цель этого протокола заключается в оценке специфичности противоопухолевых препаратов в пробирке с использованием смешанных культур , содержащих как опухолевые и не опухолевые клетки.

Abstract

Процедура оценки специфичности противоопухолевых препаратов в пробирке с использованием культур , содержащих как опухолевые , так и не-опухолевые клетки демонстрируется. Ключевым элементом является количественное определение опухоли специфических генетических изменений по отношению к универсальной последовательности с использованием цифрового анализа ПЦР с двойным зондом и последующий расчет доли опухолевых клеток. Анализ проводят на культуре, содержащей клетки опухоли налаженной линии и шипами в неопухолевых клетках. Смешанной культуры обрабатывают тестируемого лекарственного средства в различных концентрациях. После обработки ДНК получают непосредственно из уцелевших адгезивных клеток в лунки 96-луночных планшетов с использованием простой и недорогой способ, и подвергают двойной зонд цифровой ПЦР для измерения опухолеспецифичного генетического изменения и универсальной ссылочной последовательности , В данной демонстрации, гетерозиготным делеция гена NF1 используется в качестве опухолеспецифичного генетических изменений иген RPP30 в качестве контрольного гена. Используя отношение NF1 / RPP30, рассчитывалась доля опухолевых клеток. Поскольку дозозависимое изменение доли опухолевых клеток обеспечивает индикацию в пробирке на специфичность препарата, этот генетический и на основе клеток для анализа ин витро, вероятно , имеют потенциал применения в лекарственных препаратах. Кроме того, для персонализированного рака ухода, это genetic- и на основе клеток инструмент может способствовать оптимизации адъювантной химиотерапии с помощью тестирования эффективности и специфичности кандидатов лекарственных средств с использованием первичных культур отдельных опухолей.

Introduction

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools¹. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.

Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines². More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing^2-4.

An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.

This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

Protocol

1. Подготовка Mix культуры, содержащей оба опухолевых клеток и неопухолевых клеток Использование опухолевых клеток из установленной клеточной линии MPNST S462 5. Используйте фибробласты в качестве неопухолевых клеток 6,7 Культура как опухолевые клетки и фибробласты в стандартной среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (BSA), 3 мМ глутамина, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола, 500 ед / мл пенициллина, 500 мкг / мл стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия при 37 ° C и 5% СО 2 5-7. В суб-слияния, сбора клеток с 0,05% трипсина и сосчитать их с помощью гемоцитометра. Смешать 400 опухолевых клеток и 1600 не-опухолевые клетки вместе в каждую лунку планшета для культуры в 96-луночный в 0,2 мл среды. Принимая во внимание быстрый рост опухолевых клеток в течение периода лечения в течение 5 дней, начальная часть опухолевых клеток была установлена ​​на уровне 25%. Настройка 4 размножается для каждой концентрации лекарственного средства. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 O / N. 2. Druг Лечение Используйте Нилотиниб в качестве испытуемого лекарственного средства. Подготовка исходных растворов 0, 2, 4 и 20 мМ нилотиниба в ДМСО. Развести каждый из них в 200 раз в 5 мл среды DMEM, давая 2-кратно концентрированной наркоторговцев растворами 0, 10, 20 и 100 мкМ 6,7. Удалить 0,1 мл среды из каждой лунки и добавляют по 0,1 мл среды, содержащей лекарственного средства. Конечные концентрации 0, 5, 10 и 50 мкМ. Продолжить инкубацию клеток в питательной среде, содержащей препарат в течение 5 дней. В конце лечения, осмотрите прикрепленные клетки с использованием фазового контрастного микроскопа и снимать фотографии. Аспирируйте среду прочь, мыть пережившие адгезионные клетки один раз с 0,2 мл PBS. 3. Подготовка ДНК для цифровой ПЦР Клетки лизировать с использованием HotShot 8. Добавить 50 мкл раствора щелочного лизиса (25 мМ NaOH, 0,2 мМ ЭДТА) в каждую лунку. Уплотнение лунки фольгой. Инкубируйте планшет при 95 ° С в печи или на нагревательной пластине в течение 30 мин. Проверьте под MICRoscope, чтобы убедиться, что не более неповрежденные клетки оставались на поверхности лунок. В случае, если клетки не лизировали полностью, увеличьте время нагрева или добавить моющее средство. Зафиксировать их один раз при -20 ° C также усиливает разрушения клеток. Добавляют 50 мкл нейтрализующим раствором (40 мМ Трис-HC, рН 4,0) в каждую лунку. Перенос всех лизатов Into U-формы лунки пластины ПЦР и сухой в заряднника ПЦР при 95 & deg; С в течение 10 до 30 мин. Развести лизатов с 20 мкл дистиллированной воды. Обессоливания с помощью отброшенных-диализ 9 используют мембранные фильтры со средним размером пор 0,025 мкм. Поплавок фильтр на дистиллированной воде с блестящей стороной вверх в лунки 12-луночного планшета. Влажный фильтр в течение 5 мин. Обратите внимание, чтобы избежать пузырьков воздуха между фильтром и водой. Пипеткой восстановленные лизаты каждого образца из стадии 3.1.4 осторожно на на каждую из 4-х областей фильтра. Закройте планшет и диализ в течение от 30 до 60 мин. Отсасывать воду под фильтром, не переворачивая фильтр и не тревожа капли. Передача лизата-капли в лунки новой ПЦР-пластины. Сушат ДНК-капель при нагревании при 95 ° С в течение от 10 до 30 мин в заряднника ПЦР. Развести лизатов в 10 мкл воды. 4. Цифровой ПЦР Размораживайте компоненты, такие как ДНК, буфер и анализируемой смеси при комнатной температуре, со спином вниз в течение 10 сек при максимальной силе любого доступного центрифугу (например, VWR мини-центрифуга), а затем сохранить их на льду. Подготовка мастер – смеси , содержащей все компоненты , за исключением ДНК (таблица 1). Рассмотрим мертвый объем и рассчитать основную смесь примерно на 10% больше, чем необходимая сумма. Примечание: Используйте праймеры и зонды, используемые в коммерческом наборе. Vortex мастер смеси, спином вниз в течение 10 сек при максимальной силе любого доступного центрифугу (например, VWR мини-центрифуги) и отказаться от 15 мкл до каждоголунку планшета 96-ПЦР. Добавить все лизат (который содержит ДНК) каждого образца в лунки, содержащие базовую смесь. Передача 20 мкл каждой реакционной смеси в скважину на образце стороне картриджа при КТ. Распределить 70 мкл генератора капель масла в каждую лунку на стороне масла картриджа. Закройте картридж с прокладкой и поместить всю установку в генератор капель. Начало капельного поколения. Передача 40 мкл капельно-раствора в лунки 96-луночного ПЦР планшета. Уплотнение пластины с фольгой и поместите пластину в термоячейке ПЦР. Установите крышку-температуру при 105 ° С и рамп скорость при 2 ° С / сек. Выполните ПЦР с использованием параметров в таблице 2. После того , как ПЦР, перенести пластину в считывающее капельным и начать читать. В качестве альтернативы, хранить пластины при 4 ° С в течение до 24 часов. 5. Расчет Доля опухолевых клеток Загрузите цифровые данные ПЦР и выполнять автоматические Analysявляется. Контроль результатов каждого анализа вручную путем проверки одномерное и 2-мерное распределение положительных и отрицательных капель, и уверен, что они хорошо разделены и пороговые линии были в правильных позициях. Исключить результаты, не отвечающие критериям, например, нет четкого разделения положительных и отрицательных капель, из дальнейшего анализа. Скопируйте полученный коэффициент NF1 / RPP30 в листе Excel. Вычислить долю опухолевых клеток как: 2 х (1- NF1 / RPP30). 6. Дозозависимый Изменение Доля опухолевых клеток Для каждого лекарственной концентрации, вычислить среднее и стандартное отклонение от 4-х повторах. Участок средства и стандартные отклонения против наркоторговцев концентраций.

Representative Results

Качество ДНК получают с использованием комбинированных HotShot / Drop-диализ является достаточным для удовлетворительной цифровой ПЦР (рис 1B). Для 2000 фибробластов, примерно 3000 ± 500 положительных капель были получены, что соответствует 75% от ожидаемых 4000 экземпляров (в двух экземплярах в одной ячейке). В этом исследовании опухолевые клетки от установленной линии MPNST S462 , которые , как известно, имеют гетерозиготных делецию гена NF1 5. Это 50% -ное снижение дозы генов явно обнаруживается двойной цифровой ПЦР (рис 1B). В отличие от этого, две копии этого гена были измерены в фибробластах. Эта генетическая разница между опухолевыми и неопухолевых клеток позволяет рассчитать долю опухолевых клеток в смешанных культурах (рисунок 2). Путем измерения относительной дозы гена NF1 к RPP30, доля опухолевых клеток в смешанной культуре может быть определенав каждой лекарственной концентрации (рисунок 3). Рисунок 1. Цифровой ПЦР. (A) иллюстрация принципа. (В) Анализ двойного зонда показывает уменьшенное количество гена мишени (NF1) в опухолевых клетках MPNST S462 по отношению к гену ссылка (RPP30). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Рассчитано Доля опухолевых клеток. Опухолевые клетки и неопухолевой клетки смешивали в различных соотношениях и высевали в каждую лунку 96-пластины. После того, как вложение O / N, клетки лизируют остроумияч HotShot / Drop-диализ и обессоленной лизаты были подвергнуты цифровой ПЦР , который дал соотношение NF1 / RPP30. Основание на этом соотношении, вычисляли процент опухолевых клеток в каждую лунку. Среднее значение и стандартное отклонение доли опухолевых клеток рассчитывали из 4 реплицируется на каждом настроенному пропорции. Рассчитанные пропорции опухолевых клеток (Y-ось) в виде зависимости от заданных пропорциях вверх (ось х). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. дозовозависимое Изменение пропорций опухолевых клеток. (А) дозозависимое снижение видимых жизненно важных клеток. (В) , доля опухолевых клеток (среднее значение и стандартное отклонение 4 повторах) , рассчитанной из Отношение NF1: RPP30, снижение в диапазоне 0 – 10 мкМ. При самой высокой дозе 50 мкМ, несколько жизненно важных клеток были оставлены, вероятно , из – за токсического действия на все клетки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. . Рисунок 4. Разделительный Реакция опухолевых клеток от таковой неопухолевых клеток (A) , жизнеспособность или / и пролиферации всех клеток можно измерить с помощью обычных анализов; Доля опухолевых клеток может быть определена с помощью процедуры показано в настоящем исследовании. (В) с помощью двух параметров, ответ всех клеток в смешанной культуре к лекарственному средству можно разделить на реакции опухолевых клеток и реакции неопухолевых клеток..com / файлы / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 1 Реакция 2 х ddPCR СУПЕРМИКС 12 Анализ смеси для NF1 1.2 Анализ смеси для RPP30 1.2 HaeIII 0,6 Промежуточный итог 15 Мастер смесь ДНК 9 Всего 24 Заключительный ПЦР Смесь Таблица 1 Настройка Dual ddPCR Реакция шаг действие температура Время циклы 1 Polymстереть активацию 95 ° C 10 минут 1 2 денатурация ДНК 94 ° C 30 сек 40 3 Отжиг / exetension 60 ° C 1 мин 4 полимеразной деактивация 98 ° C 10 минут 1 5 Удержание (по желанию) 4 ° C Таблица 2 Параметры PCR Cycler

Discussion

Ключевым шагом в этом genetic- и на основе клеток инструментом для оценки специфичности лекарственного средства в пробирке является определение доли опухолевых клеток с использованием одного или более опухольспецифические генетические особенности. В отличие от обычных фенотипических признаков ^7, генетические особенности характерны, стабильны и легко поддаются количественному определению . Например, опухоль-специфичный мутагенез или число копий изменение присутствует исключительно в опухолевых клетках, но не в неопухолевых клетках. Такая генетическая клеймо может быть надежно и точно количественно, например, с использованием цифровой ПЦР, как показано в этом исследовании.

Для цифровой ПЦР, высокая чистота ДНК не является существенным. Тем не менее, обессоливание и удаление ингибирующих молекулы необходимы, которые могут быть достигнуты с помощью капельного диализа с использованием соответствующего фильтра. Комбинированный лизис и раскрывающихся диализ является простым и быстрым, не требует каких-либо специальных инструментов и, следовательно, могут быть выполнены в любой стандартной лаборатории. Если клетки не Breaа K, дополнительное лечение можно считать такие, как замораживание клеток при -20 ° С, при добавлении моющего средства или / и с помощью протеазы.

В настоящем исследовании, гетерозиготного делеция гена NF1 был использован в качестве признака опухолеспецифичного для количественной оценки. Аналогичным образом, могут быть также использованы делеции других генов или локусов. Кроме того, мутации могут также быть использованы для количественной оценки опухолевых клеток. В таком случае, цифровые ПЦР-анализы для мутантом и нормальные аллели должны быть тщательно проверены, чтобы гарантировать их специфичность в отношении каждого из них.

Дозозависимый доля опухолевых клеток обеспечивает индикацию для лекарственной специфичности или селективности. Кроме того, это также дает возможность извлекающий реакцию опухолевых клеток из ответа общего количества клеток смешанной культуры к лекарственному средству (рисунок 4). Эта стратегия извлечения обеспечивает решение для поставленной технической задачи в использовании первичных культур (который содержит в себе как опухоль и нетн-опухолевых клеток) для тестирования наркотиков.

Genetic- и на основе клеток в пробирке инструмента показано в настоящем исследовании , поэтому может иметь потенциал применения (1) в лекарственной открытия , где она обеспечивает платформу для оценки специфичности лекарственного средства или селективности в пробирке и (2) в персонализированного лечения рака , где его позволяет проводить тестирование лекарств в первичных культурах и , следовательно , может способствовать лекарственной селекции в адъювантной химиотерапии ^4. Кроме того, фармакологический механизм лекарственного средства могут быть изучены с помощью этого инструмента, так как определенные генетические изменения или множественные генетические изменения могут последовать в течение лекарственной терапии.

Трудность в использовании индивидуализированных первичных культур является отсутствие универсальной генетической особенностью для количественной оценки опухолевых клеток. Тем не менее, с сегодняшнего продвижения в целом-генома, наиболее часто видоизмененные гены и регионы известны общие опухолей. Например, среди головы и шеиопухоли, 71%, 23% и 22% имеют мутации в TP53, FAT1 и гены CDKN2A, а 60%, 34% и 26% имеют делеции в гене регионах CDKN2A, STK11 и PTEN, соответственно ^10. Скрининг от 5 до 10 таких генов или / и регионов посредством целенаправленного секвенирование / или цифровой ПЦР будет, следовательно, скорее всего, идентифицировать один или более генетических изменений, которые могут быть использованы для определения количества опухолевых клеток в полученной первичной культуре. Другим ограничением является часто недостаточное количество резекции опухоли для создания первичных культур.

Несмотря на выгодные особенности и перспективно применение потенциала genetic- и на основе клеток в пробирке инструмента, его ограничения следует иметь в виду , и его в пробирке природы следует подчеркнуть. Например, дифференциальные эффекты или цитотоксичность препарата на опухолевые клетки могут скорее из-за разницы в типах клеток (фибробласты против шванновских клеток) или ихразличного происхождения (от разных людей). Чем сильнее воздействие препарата на опухолевые клетки, чем на неопухолевых клетках также может быть связано с тем, что бывший растут быстрее, чем последний. Самое главное, что клетки in vitro на поведение отличается , чем клетки в организме человека и , следовательно, результаты оценки ин витро часто не имеют или только частично отражают реальную клиническую ситуацию. Таким образом, эффективность, цитотоксичность и специфичность препаратов, полученных для культивируемых клеток, являются скорее биомаркеров природы, но не имеют надежности доклинически измеренной эффективности антибиотиков. Тем не менее, переход от клеточных линий смешанных культур и / или первичных культур является шагом вперед в оценке наркотиков эффект и специфичности / селективности в лабораторных условиях . При обширных усилий, в условиях лабораторных можно найти , что позволяет разумную корреляцию данных в пробирке с реальными ответами пациентов, по крайней мере , для некоторых лекарств.

Materials

membrane filter of 25 mm diameter	Merk-Millipore	VSWP 02500	for drop-dialysis
ddPCR assay for NF1	BioRad	dHsaCP1000177	FAM-labelled
ddPCR assay for RPP30	BioRad	dHsaCP2500350	HEX-labelled
QX200	BioRad	186-4001	the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200
Droplet oil	BioRad	186-3005
Cartriges	BioRad	186-3004
Gaskets	BioRad	186-3009
Cartrige holder	BioRad	186-3051
pierceble foil	BioRad	181-4040