O objetivo deste protocolo é o de avaliar a especificidade de drogas anticâncer in vitro utilizando culturas mistas que contêm células tumorais tanto e não-tumorais.
Um procedimento para avaliar a especificidade de drogas anticancro in vitro utilizando culturas de células que contêm ambos tumorais e não tumorais é demonstrada. O elemento chave é a determinação quantitativa de uma alteração genética específica do tumor em relação a uma sequência universal usando um ensaio de PCR digital duplo-sonda e o cálculo subsequente da proporção de células de tumor. O ensaio é realizado em uma cultura contendo células de tumor de uma linha estabelecida e cravado-em células não tumorais. A cultura mista é tratado com um fármaco de teste a várias concentrações. Após o tratamento, o DNA é preparado directamente a partir das células adesivas sobreviveram em poços de placas de 96 poços utilizando um método simples e barato, e submetido a um ensaio de PCR digital duplo-sonda para a medição de uma alteração genética específica de tumores e uma sequência universal de referência . Na presente demonstração, uma deleção heterozigoto do gene NF1 é usado como a alteração genética específica de tumores eum gene RPP30 como gene de referência. Usando a relação NF1 / RPP30, calculou-se a proporção de células tumorais. Uma vez que a alteração dependente da dose da percentagem de células de tumor fornece uma indicação in vitro para a especificidade da droga, e este ensaio genético à base de células in vitro provavelmente terão potencial aplicação na descoberta de medicamentos. Além disso, para o cancro de cuidados personalizado, esta ferramenta genético-e à base de células pode contribuir para a optimização de quimioterapia adjuvante, por meio de testes de eficácia e especificidade de fármacos candidatos utilizando culturas primárias de tumores individuais.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
O passo chave nesta ferramenta genético-e à base de células para avaliar a especificidade de drogas in vitro é a determinação da proporção de células de tumor, utilizando um ou mais recursos genéticos específicos do tumor. Em contraste com características fenotípicas convencionais 7, características genéticas são específicos, estável e fácil de quantificar. Por exemplo, uma mutação ou variação do número de cópias específico do tumor está presente exclusivamente em células tumorais, mas não em células não tumorais. Tal estigma genética pode ser fiável e quantificado precisamente, por exemplo, utilizando PCR digital como demonstrado no presente estudo.
Para a PCR digitais, de alta pureza de ADN não é essencial. No entanto, dessalinização e remoção das moléculas inibidoras são necessários o que pode ser conseguido por uma gota-a diálise utilizando um filtro adequado. A lise e gota-a diálise combinada é simples e rápido, não requer instrumentos especiais e, por conseguinte, pode ser realizado em qualquer laboratório padrão. Se as células não Break bem, tratamento adicional pode ser considerado tal como a congelação das células a -20 ° C, adicionando detergentes e / ou utilizando protease.
No presente estudo, a supressão heterozigoto do gene NF1 foi usado como o recurso específico de tumor para a quantificação. Da mesma forma, também pode ser utilizado deleções de outros genes ou loci. Além disso, as mutações também podem ser utilizadas para quantificar as células tumorais. Em tal caso, os ensaios de PCR para o mutante digitais e os alelos normais têm de ser extensivamente validado para garantir a sua especificidade para cada um deles.
proporção dependente da dose de células de tumor fornece uma indicação para o fármaco-especificidade ou selectividade. Além disso, ela também permite extrair a resposta das células tumorais a partir da resposta do número total de células de uma cultura mista de uma droga (Figura 4). Esta estratégia de extracção fornece uma solução para o problema técnico em utilizar culturas primárias (que contém tanto do tumor e nãocélulas de n-tumor) por drogas-teste.
A genético-celular e baseada na ferramenta vitro demonstrado no presente estudo pode, portanto, tem potencial de aplicação (1) em droga-descoberta, onde ele fornece uma plataforma para avaliar a especificidade de drogas ou a selectividade in vitro e (2) no tratamento personalizado do câncer onde ele permite drogas de teste em culturas primárias e, consequentemente, pode contribuir para a droga-seleção na quimioterapia adjuvante 4. Além disso, o mecanismo farmacológico de uma droga pode ser estudada usando esta ferramenta, uma vez que certa alteração genética ou alterações genéticas múltiplas podem ser seguidas durante a droga do tratamento.
Uma dificuldade na utilização de culturas primárias individualizadas é a falta de uma característica genética universal para a quantificação das células tumorais. No entanto, com o avanço de hoje na sequenciação de todo o genoma, os genes e regiões mais frequentemente alteradas são conhecidos por tumores comuns. Por exemplo, entre cabeça e pescoçotumores, 71%, 23% e 22% têm mutações em TP53, FAT1 e genes CDKN2A, e 60%, 34% e 26% têm deleções nas regiões do gene de CDKN2A, STK11 e PTEN, respectivamente 10. Rastreio de 5 a 10 tais genes e / ou as regiões através de sequenciação-alvo e / ou de PCR digital irá, portanto, provável identificar uma ou mais alterações genéticas que podem ser utilizadas para a quantificação das células tumorais na cultura primária derivada. Outra limitação é a quantidade muitas vezes insuficiente de tumores ressecados para a criação de culturas primárias.
Apesar das características vantajosas ea aplicação potencial promissor da genético-e na ferramenta vitro baseado em células, as suas limitações devem ser mantidos em mente e sua natureza in vitro devem ser enfatizados. Por exemplo, os efeitos diferenciais ou citotoxicidade de um fármaco em células tumorais podem, em vez devido à diferença de tipos de células (células de Schwann contra fibroblastos) ou os seusdiferentes origens (de diferentes indivíduos). O efeito mais forte de um fármaco em células tumorais do que em células não tumorais também pode ser explicada pelo facto de que o primeiro crescer mais rapidamente do que o último. Mais importante, as células no comportamento vitro difere do que as células no corpo humano e, consequentemente, os resultados da avaliação in vitro muitas vezes não ou apenas parcialmente reflectir a situação clínica real. Portanto, a eficácia, a citotoxicidade e a especificidade das drogas obtidos para células cultivadas são em vez de biomarcador natureza, mas não têm a fiabilidade da eficácia pré-clinicamente medido de antibióticos. No entanto, movendo-se de linhas celulares para culturas mistas e / ou culturas primárias é um passo em frente na avaliação fármaco-efeito e especificidade / seletividade in vitro. Com grandes esforços, em condições in vitro, pode ser encontrado o que permite uma correlação razoável de dados in vitro com respostas reais dos pacientes, pelo menos para algumas drogas.
The authors have nothing to disclose.
Sra Alster, o Sr. Honrath e Dr. Jiang são apreciados pela sua excelente assistência técnica. Também é apreciado Dr. Volz e do grupo de pesquisa do Dr. Dandri para fornecer o acesso ao seu dispositivo de PCR digital.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |