Het doel van dit protocol is om de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro die gemengde kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen beoordelen.
Een methode voor de specificiteit van geneesmiddelen tegen kanker in vitro middels kweken die zowel tumor- en non-tumorcellen aangetoond. Centraal staat de kwantitatieve bepaling van een tumor-specifieke genetische verandering ten opzichte van een universele sequentie met een dual-probe digitale PCR en de daaropvolgende berekening van het percentage van tumorcellen. De test wordt uitgevoerd op een kweek die tumorcellen van een gevestigde lijn en droeg spiked-in niet-tumorcellen. De gemengde kweek wordt behandeld met een testgeneesmiddel in verschillende concentraties. Na de behandeling wordt DNA rechtstreeks bereid uit de overleefden klevende cellen in putjes van 96-putjes platen met behulp van een eenvoudige en goedkope werkwijze en onderworpen aan een dual-probe digitale PCR-test voor het meten van een tumor-specifieke genetische verandering en referentie universele sequentie . In deze demonstratie wordt een heterozygote deletie van het NF1 gen als tumor-specifieke genetische verandering eneen RPP30 gen als het referentie-gen. De verhouding NF1 / RPP30, werd het percentage tumorcellen berekend. Aangezien de dosis-afhankelijke verandering van het aantal tumorcellen verschaft een in vitro indicatie voor specificiteit van het geneesmiddel, dit genetische en op cellen gebaseerde in vitro assay waarschijnlijk toepassingsmogelijkheden in drug discovery. Verder is het voor gepersonaliseerde kanker-care kan dit genetisch en op cellen gebaseerde hulpmiddel een bijdrage leveren aan het optimaliseren van adjuvante chemotherapie door middel van het testen van de werkzaamheid en de specificiteit van kandidaat-medicijnen met behulp van primaire kweken van individuele tumoren.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
De belangrijkste stap in deze genetisch en op cellen gebaseerde instrument voor de beoordeling van geneesmiddelen specificiteit in vitro bepaling van de hoeveelheid tumorcellen via een of meer tumor-specifieke genetische eigenschappen. In tegenstelling tot conventionele fenotypische kenmerken 7, genetische kenmerken zijn bepaald, stabiel en gemakkelijk te kwantificeren. Bijvoorbeeld een tumor-specifieke mutatie of copy number variation aanwezig uitsluitend de tumorcellen, maar niet in niet-tumorcellen. Een dergelijke genetische stigma betrouwbaar en precies gekwantificeerd, bijvoorbeeld onder gebruikmaking van digitale PCR zoals aangetoond in deze studie.
Voor digitale PCR, hoge zuiverheid van DNA is niet essentieel. Echter, ontzouten en verwijderen van remmende moleculen nodig die kunnen worden bereikt door een drop-dialyse met een geschikt filter. De gecombineerde lyse en drop-dialyse is eenvoudig en snel, vereist geen speciale instrumenten en derhalve kan op elke standaard laboratorium worden uitgevoerd. Als de cellen niet breaen k, kunnen aanvullende behandeling worden genomen zoals het bevriezen van de cellen bij -20 ° C, het toevoegen van detergens en / of gebruiken protease.
In deze studie, de heterozygote deletie van het NF1-gen werd gebruikt als tumor-specifieke eigenschap voor de kwantificering. Evenzo deleties van andere genen of loci kunnen ook worden gebruikt. Verder kunnen mutaties ook worden gebruikt voor het kwantificeren van tumorcellen. In dat geval digitaal PCR assays voor de mutant en de normale allelen moeten grondig worden gevalideerd hun specificiteit voor elk daarvan waarborgen.
Dosisafhankelijke percentage tumorcellen een indicatie voor drug-specificiteit of selectiviteit. Voorts maakt ook toe respons van tumorcellen uit de reactie van totale cellen van een gemengde kweek van een geneesmiddel (figuur 4). Deze extractie strategie verschaft een oplossing voor het technische probleem bij het gebruik van primaire kweken (die zowel tumor en bevat geenn-tumorcellen) voor drug-testen.
De genetisch en cell-based in vitro hulpmiddel gedemonstreerd in de huidige studie kan daarom toepassingsmogelijkheden (1) in drug-discovery, waar het biedt een platform voor de beoordeling van geneesmiddelen specificiteit of selectiviteit in vitro en (2) in gepersonaliseerde oncologische zorg waar het maakt het testen van drugs in primaire kweken en dus kan bijdragen aan drugs-selectie in adjuvante chemotherapie 4. Verder kunnen farmacologisch mechanisme van een geneesmiddel worden bestudeerd met dit hulpmiddel, aangezien bepaalde genetische verandering of meer genetische veranderingen in de drug-behandeling kan worden gevolgd.
Een moeilijkheid bij het gebruik van individuele primaire kweken is het ontbreken van een universele genetische eigenschap voor de kwantificering van de tumorcellen. Echter, met de huidige vooruitgang in hele genoom, de meest veranderde genen en gebieden zijn bekend voor zachte tumoren. Bijvoorbeeld, onder het hoofd en de nektumoren, 71%, 23% en 22% hebben mutaties in de TP53, FAT1 en CDKN2A genen en 60%, 34% en 26% hebben deleties in het gen regio CDKN2A, STK11 en PTEN, respectievelijk 10. Screening 5 tot 10 dergelijke genen en / of gebieden door gerichte sequencing en / of digitale PCR zal daarom waarschijnlijk identificeren van één of meer genetische veranderingen die kunnen worden gebruikt voor de kwantificering van tumorcellen in de verkregen primaire kweek. Een andere beperking is het vaak onvoldoende hoeveelheid weggesneden tumoren opzetten primaire kweken.
Ondanks de voordelige eigenschappen en veelbelovende toepassing potentieel van de genetisch en op cellen gebaseerde in vitro tool, maar heeft haar beperkingen in het achterhoofd worden gehouden en de in vitro aard moet worden benadrukt. Bijvoorbeeld, de differentiële effecten of cytotoxiciteit van geneesmiddel op tumorcellen plaats als gevolg van verschil in celtypes (fibroblasten versus Schwann-cellen) of hunverschillende oorsprong (uit verschillende individuen). Hoe sterker effect van een geneesmiddel op tumorcellen dan op niet-tumorcellen kan ook worden verklaard door het feit dat de eerstgenoemde sneller groeien dan de laatste. Belangrijker, cellen in vitro gedrag verschilt dan cellen in het menselijk lichaam en dus de resultaten van in vitro assessment vaak niet of slechts gedeeltelijk overeen met de werkelijke klinische situatie. Daarom werkzaamheid, specificiteit en cytotoxiciteit van geneesmiddelen verkregen gekweekte cellen zijn eerder biomarker van aard, maar niet de betrouwbaarheid van gemeten preklinisch werkzaamheid van antibiotica. Niettemin verplaatsen van cellijnen gemengde kweken en / of primaire kweken is een stap voorwaarts bij de beoordeling drug-effect en specificiteit / selectiviteit in vitro. Met grote inspanningen, in vitro omstandigheden te vinden die redelijk correlatie van in vitro gegevens met echte reacties van patiënten, althans voor sommige geneesmiddelen mogelijk maakt.
The authors have nothing to disclose.
Mevrouw Alster, de heer Honrath en Dr. Jiang worden gewaardeerd om hun uitstekende technische bijstand. Ook gewaardeerd is Dr. Volz en de onderzoeksgroep van Dr. Dandri voor het verstrekken van de toegang tot hun digitale PCR-apparaat.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |