El objetivo de este protocolo es evaluar la especificidad de los medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos mixtos que contienen células tumorales tanto y no tumorales.
Un procedimiento para evaluar la especificidad de medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos que contienen células tanto tumorales y no tumorales se demuestra. El elemento clave es la determinación cuantitativa de una alteración genética específica de tumor en relación con una secuencia universal, usando un ensayo de PCR digitales de doble sonda y el posterior cálculo de la proporción de células tumorales. El ensayo se lleva a cabo en un cultivo que contiene células tumorales de una línea establecida y enriquecida en células no tumorales. El cultivo mixto es tratado con un fármaco de ensayo a diversas concentraciones. Después del tratamiento, el ADN se prepara directamente a partir de las células adhesivas sobrevivido en pocillos de placas de 96 pocillos usando un método simple y de bajo costo, y se sometió a un ensayo de PCR digital dual de la sonda para la medición de una alteración genética específica de tumor y una secuencia de referencia Universal . En la presente demostración, una deleción heterocigota del gen NF1 se utiliza como la alteración genética específica del tumor yun gen RPP30 como el gen de referencia. Usando la relación NF1 / RPP30, se calculó la proporción de células tumorales. Puesto que el cambio dependiente de la dosis de la proporción de células tumorales proporciona una indicación in vitro de la especificidad del fármaco, este ensayo genético y basado en células in vitro es probable que tenga potencial de aplicación en el descubrimiento de fármacos. Además, para el cuidado personalizado del cáncer, esta herramienta genético-y basado en células puede contribuir a la optimización de la quimioterapia adyuvante por medio de probar la eficacia y la especificidad de los fármacos candidatos utilizando cultivos primarios de tumores individuales.
Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios.
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated.
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.
El paso clave en esta herramienta genético-y basado en células para la evaluación de especificidad fármaco in vitro es la determinación de la proporción de las células tumorales utilizando una o más características genéticas específicas de tumor. En contraste con características fenotípicas convencionales 7, las características genéticas son específicos, estable y fácil de cuantificar. Por ejemplo, una variación mutación o el número de copias específico de tumor está presente exclusivamente en las células tumorales pero no en células no tumorales. un estigma genético de este tipo puede ser fiable y precisa cuantificada, por ejemplo, usando PCR digital como se demuestra en este estudio.
Para la PCR digital, de alta pureza de ADN no es esencial. Sin embargo, la desalinización y la eliminación de moléculas inhibidoras son necesarios que se puede lograr por una caída de la diálisis usando un filtro adecuado. La lisis y la caída de la diálisis combinado es simple y rápido, no requiere instrumentos especiales y por lo tanto puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio estándar. Si las células no break bien, el tratamiento adicional puede ser considerada como la congelación de las células a -20 ° C, la adición de detergente o / y el uso de la proteasa.
En el presente estudio, se utilizó la deleción heterocigota del gen NF1 como la característica específica de tumor para la cuantificación. Del mismo modo, las deleciones de otros genes o loci también se pueden utilizar. Además, las mutaciones también se pueden utilizar para la cuantificación de células tumorales. En tal caso, los ensayos de PCR digitales para el mutante y los alelos normales necesitan ser ampliamente validado para asegurar su especificidad para cada uno de ellos.
proporción dependiente de la dosis de las células tumorales proporciona una indicación para el fármaco-especificidad o selectividad. Además, también permite la extracción de la respuesta de las células tumorales a partir de la respuesta del total de células de un cultivo mixto a un fármaco (figura 4). Esta estrategia de extracción proporciona una solución para el problema técnico en el uso de cultivos primarios (que contiene tanto tumor y nocélulas n-tumor) para pruebas de drogas.
El genético-y basados en células in vitro herramienta demostrado en el presente estudio, por tanto, pueden tener un potencial de aplicación (1) en el descubrimiento de medicamentos donde proporciona una plataforma para evaluar la especificidad o selectividad de drogas in vitro y (2) en la atención personalizada del cáncer donde permite a los fármacos de ensayo en cultivos primarios y por lo tanto pueden contribuir a la selección de drogas en la quimioterapia adyuvante 4. Por otra parte, el mecanismo farmacológico de un medicamento puede ser estudiada usando esta herramienta, ya que cierta alteración genética o alteraciones genéticas múltiples pueden ser seguidos durante el tratamiento con fármaco.
Una dificultad en el uso de cultivos primarios individualizadas es la falta una característica genético universal para la cuantificación de las células tumorales. Sin embargo, con el avance de hoy en la secuenciación de todo el genoma, los genes y las regiones más frecuentemente alterados son conocidos por tumores comunes. Por ejemplo, entre la cabeza y el cuellotumores, 71%, 23% y 22% tienen mutaciones en el gen TP53, FAT1 y genes CDKN2A, y el 60%, 34% y 26% tienen deleciones en las regiones de genes de CDKN2A, STK11 y PTEN, respectivamente 10. Screening 5 a 10 tales genes o / y regiones por medio de la secuenciación dirigida y / o PCR digital tanto, es probable identificar una o más alteraciones genéticas que se pueden usar para la cuantificación de células tumorales en el cultivo primario derivada. Otra limitación es la cantidad a menudo insuficiente de tumores resecados para el establecimiento de cultivos primarios.
A pesar de las características ventajosas y su potencial aplicación prometedora de la genético-herramienta y en vitro basados en células, sus limitaciones se deben tener en mente y su naturaleza in vitro deben ser resaltados. Por ejemplo, los efectos diferenciales o la citotoxicidad de un fármaco sobre las células tumorales puede más bien debido a la diferencia en los tipos de células (fibroblastos en comparación con las células de Schwann) o sudiferentes orígenes (de diferentes individuos). El efecto más fuerte de un fármaco sobre las células tumorales que en células no tumorales también puede explicarse por el hecho de que el primero crecen más rápido que el segundo. Lo más importante, las células en el comportamiento in vitro difieren de las células en el cuerpo humano y, en consecuencia, los resultados de la evaluación in vitro a menudo no o sólo parcialmente reflejan la situación clínica real. Por lo tanto, la eficacia, la citotoxicidad y especificidad de los medicamentos obtenidos para las células cultivadas son más bien de naturaleza biomarcador, pero no tienen la fiabilidad de la eficacia preclínica medido de antibióticos. Sin embargo, al pasar de líneas celulares a cultivos mixtos y / o cultivos primarios es un paso adelante en la evaluación de medicamentos de efecto y la especificidad / selectividad in vitro. Con grandes esfuerzos, en condiciones in vitro se puede encontrar que permite correlación razonable de los datos in vitro con las respuestas reales de los pacientes, al menos para algunos medicamentos.
The authors have nothing to disclose.
La señora Alster, el Sr. Honrath y el Dr. Jiang son apreciados por su excelente asistencia técnica. También aprecia es el Dr. Volz y el grupo de investigación del Dr. Dandri para proporcionar el acceso a su dispositivo digital PCR.
membrane filter of 25 mm diameter | Merk-Millipore | VSWP 02500 | for drop-dialysis |
ddPCR assay for NF1 | BioRad | dHsaCP1000177 | FAM-labelled |
ddPCR assay for RPP30 | BioRad | dHsaCP2500350 | HEX-labelled |
QX200 | BioRad | 186-4001 | the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200 |
Droplet oil | BioRad | 186-3005 | |
Cartriges | BioRad | 186-3004 | |
Gaskets | BioRad | 186-3009 | |
Cartrige holder | BioRad | 186-3051 | |
pierceble foil | BioRad | 181-4040 |