Dirigido Método Evolução<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens atraentes no projecto enzimas para aplicações biotecnológicas, um processo que envolve a construção, clonagem e expressão de bibliotecas de mutantes, acoplada a alta frequência de recombinação homóloga de ADN in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo para criar e bibliotecas mutantes tela em leveduras com base no exemplo de um fúngica oxidase aril-álcool (AAO) para melhorar a sua actividade total. Dois segmentos de proteína foram sujeitos a evolução focalizado dirigido por mutagénese aleatória de ADN e na recombinação in vivo. Saliências de ~ 50 pb que flanqueia cada segmento permitiu a remontagem correcta do gene AAO-fusão num vector linearizado dando origem a um total de plasmídeo de replicação autónoma. Bibliotecas mutantes enriquecidos com variantes funcionais da AAO foram rastreados em S. cerevisiae sobrenadantes com um ensaio de elevado débito sensível com base na reacção de Fenton. O processo geral dea construção da biblioteca em S. cerevisiae aqui descrito pode ser facilmente aplicado a evoluir muitos outros genes eucarióticos, evitando reacções adicionais de PCR in vitro de recombinação de DNA e ligação etapas.

Introduction

Evolução molecular dirigida é um método robusto, rápido e fiável para conceber enzimas ^{1, 2.} Através de ciclos iterativos de aleatória mutação, recombinação e selecção, versões melhoradas das enzimas pode ser gerado que actuam sobre novos substratos, em novas reacções, em não-naturais ambientes, ou até mesmo para ajudar a célula de atingir novos objectivos metabólicas ^3-5. Entre os anfitriões utilizados na evolução dirigida, levedura Saccharomyces cerevisiae da cervejaria oferece um repertório de soluções para a expressão funcional de proteínas eucarióticas complexas que não estejam disponíveis em vias procariotas ^6,7.

Utilizado exaustivamente em estudos de biologia celular, este pequeno modelo eucariótico tem muitas vantagens em termos de modificações pós-traducionais, a facilidade de manipulação e transformação eficiência, todos os quais são características importantes de engenheiro enzimas por evolução dirigida ^8. Por outro lado, a alta frequênciarecombinação homóloga de ADN em S. cerevisiae acoplado ao seu aparelho à prova de leitura eficiente abre um vasto leque de possibilidades para a criação de biblioteca e montagem de gene in vivo, promovendo a evolução de diferentes sistemas de enzimas individuais para vias artificiais complexos ^9-12. Nosso laboratório passou a última década projetando ferramentas e estratégias para a evolução molecular de diferentes ligninases em levedura (Oxirredutases envolvidas na degradação da lignina durante o decaimento de madeira natural) ^13-14. Nesta comunicação, nós apresentamos um protocolo detalhado para preparar e bibliotecas mutantes tela em S. cerevisiae para um modelo flavooxidase, -aril-oxidase de álcool (AAO ¹⁵⁾ -, que podem ser facilmente convertidos para muitas outras enzimas. O protocolo envolve um método evolução focada-dirigida (MORPHING: Processo mutagênicos Organizado recombinação homóloga di vivo pelo Agrupamento) assistida pelo aparelho celular de levedura ^16, umda ensaio de rastreio muito sensível com base na reacção de Fenton, a fim de detectar a actividade AAO secretado para o caldo de cultura ^17.

Protocol

1. Construção do mutante Biblioteca Escolher as regiões a ser submetido à transição com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura de cristal ou homologia modelos disponíveis 18. Aqui, como alvo duas regiões de AAO de Pleurotus eryngii de mutagénese aleatória e recombinação (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), enquanto amplifica o restante do gene (844 pb) por PCR de alta fidelidade (Figura 1). Nota: Vários segme…

Representative Results

AAO de P. eryngii é um flavooxidase extracelular que abastece as peroxidases fúngicas com H 2 O 2 para começar a atacar a lignina. Dois segmentos de AAO foram submetidos a evolução focada-dirigido por MORPHING, a fim de melhorar a sua actividade e a sua expressão em S. cerevisiae 19. Independentemente das enzimas estrangeiras abrigadas por S. cerevisiae, o problema mais crítico, quando a construção de bibliotecas de mut…

Discussion

Neste artigo, nós resumimos a maioria das dicas e truques empregados no nosso laboratório para projetar enzimas por evolução dirigida em S. cerevisiae (AAO utilizando como exemplo) de modo que eles podem ser adaptados para utilização com muitos outros sistemas enzima eucariótica, simplesmente seguindo a abordagem comum descrito aqui.

Em termos de criação de biblioteca, Metamorfose é um método one-pot rápido para introduzir e recombinar mutações aleatórias em trechos d…

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)