Geregisseerd Evolution Method in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Evolutie in Saccharomyces cerevisiae biedt vele aantrekkelijke voordelen bij het ​​ontwerpen van enzymen voor biotechnologische toepassingen, een proces dat de constructie, klonering en expressie van mutante bibliotheken, gekoppeld met hoge frequentie homologe DNA recombinatie in vivo omvat. Hier presenteren we een protocol en het scherm mutante bibliotheken in gist hand van het voorbeeld van een schimmel aryl-alcohol oxidase (AAO) om haar totale activiteit verhogen creëren. Twee eiwitsegmenten werden onderworpen aan gerichte gerichte evolutie door willekeurige mutagenese en DNA in vivo recombinatie. Overhangen ~ 50 bp flankerend elk segment kon de juiste montage van de AAO-fusiegen in een gelineariseerde vector waardoor een volledig autonoom replicerend plasmide. Mutant bibliotheken verrijkt met functionele AAO varianten werden vertoond in S. cerevisiae supernatanten met een gevoelige high-throughput assay gebaseerd op de Fenton reactie. Het algemene proces vanbibliotheek bouw in S. cerevisiae beschreven kunnen gemakkelijk worden toegepast op vele andere eukaryote genen evolueren vermijden extra PCR reacties, in vitro DNA recombinatie en ligatiestappen.

Introduction

Gerichte moleculaire evolutie is een robuuste, snelle en betrouwbare methode om enzymen ontwerpen ^{1, 2.} Door iteratieve ronden van willekeurige mutatie, recombinatie en screening, verbeterde versies van enzymen kan worden gegenereerd die inwerken op nieuwe substraten in nieuwe reacties, in niet-natuurlijke omgevingen of zelfs de cel te helpen nieuwe metabole doelen ^3-5 bereiken. Onder de gastheren gebruikt in gerichte evolutie, van de brouwer gist Saccharomyces cerevisiae heeft een repertoire van oplossingen voor de functionele expressie van complexe eukaryote eiwitten die anders niet beschikbaar in prokaryotische tegenhangers ^6,7 zijn.

Uitvoerig gebruikt in celbiologische Dit kleine eukaryotische model heeft vele voordelen in termen van posttranslationele modificaties, gemakkelijke manipulatie en transformatie-efficiëntie, die allemaal belangrijke eigenschappen om enzymen te construeren door gerichte evolutie ^8. Bovendien is de hoogfrequentevan homologe DNA recombinatie in S. cerevisiae gekoppeld aan een efficiënte proof-leesapparaat opent een breed scala aan mogelijkheden voor de bibliotheek creatie en gen-assemblage in vivo, het bevorderen van de ontwikkeling van verschillende systemen van enkele enzymen om complexe kunstmatige paden ^9-12. Ons laboratorium heeft de afgelopen tien jaar van het ontwerp gereedschappen en strategieën voor de moleculaire evolutie van verschillende ligninasen in gist (oxidoreductases betrokken bij de afbraak van lignine in het hout verval) ^13-14. In deze mededeling, presenteren we een gedetailleerd protocol voor te bereiden en het scherm mutant bibliotheken in S. cerevisiae een model flavooxidase, -aryl-alcohol oxidase (AAO ¹⁵⁾ -, welke gemakkelijk vertalen vele andere enzymen. Het protocol gaat om een gerichte-evolutie methode (MORPHING: Mutageen Organized Recombinatie Process door homologe di vivo Groepering) bijgestaan ​​door het gistcel apparaat ^16, eenda zeer gevoelige screening assay gebaseerd op de Fenton reactie om AAO activiteit afgescheiden in het kweekmedium ¹⁷ te detecteren.

Protocol

1. Mutant Bibliotheek Construction Kies de regio's moeten worden onderworpen aan MORPHING met behulp van algoritmes op basis van de beschikbare kristalstructuur of homologie modellen 18. Hier targeten twee gebieden van AAO van Pleurotus voor willekeurige mutagenese en recombinatie (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), terwijl de rest amplificeren van het gen (844 bp) van high-fidelity PCR (figuur 1). Opmerking: Meerdere segmenten kunnen w…

Representative Results

AAO van P. eryngii is een extracellulair flavooxidase dat schimmel peroxidasen voorziet van H 2 O 2 beginnen aanvallen lignine. Twee segmenten van AAO werden onderworpen aan gerichte evolutie van MORPHING om de activiteit en de expressie in S. verbeteren 19 cerevisiae. Ongeacht de buitenlandse enzymen koesterde door S. cerevisiae, de meest kritieke punt bij de bouw mutant bibliotheken in gist betreft de engineering van …

Discussion

In dit artikel hebben we samengevat het grootste deel van de tips en trucs die werkzaam zijn in ons laboratorium om enzymen ingenieur door gerichte evolutie in S. cerevisiae (met AAO ter illustratie) zodat ze kunnen worden aangepast voor gebruik met vele andere eukaryote enzymsystemen door simpelweg na de gemeenschappelijke benadering beschreven.

Qua bibliotheek schepping MORPHING is een snel-pot methode te introduceren en recombineren willekeurige mutaties in kleine stukjes eiwit t…

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)