指向進化方法で<em>サッカロマイセス・セレビシエ</em>：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング
Summary
We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
生物工学的適用のための酵素を設計する際、サッカロマイセス・セレビシエにおける指向進化は、 生体内での高頻度の相同DNA組換えに結合された、突然変異体ライブラリーの構築、クローニングおよび発現を含むプロセスを多くの魅力的な利点を提供しています。ここでは、その総活性を高めるために、真菌のアリールアルコールオキシダーゼ（AAO）の例に基づいて酵母に変異ライブラリを作成し、画面ためのプロトコルを提示します。 2つのタンパク質セグメントは、ランダム突然変異誘発によっておよびin vivo DNA組換えに焦点を当てた、指向性進化に供しました。各セグメントに隣接〜50塩基対のオーバーハングは、完全な自己複製プラスミドを生じさせる線状化ベクターでAAO-融合遺伝子の正しい再組み立てを可能にしました。機能性AAO変種で強化された変異体のライブラリーは、Sでスクリーニングしましたフェントン反応に基づいて敏感なハイスループットアッセイとセレビシエ上清。の一般的なプロセスS.でライブラリー構築セレビシエは、余分なPCR反応を、 インビトロでの DNA組換え及びライゲーション手順を回避する、ここに記載さ容易に多くの他の真核生物の遺伝子を進化させるために適用することができます。
Introduction
監督分子進化は、酵素1、2を設計するため、堅牢な高速かつ信頼性の高い方法である。ランダム変異、組換えおよびスクリーニングの反復ラウンドを通じて、酵素の改良されたバージョンは、非天然で、小説の反応で、新しい基板に作用を生成することができます環境は、さらに新たな代謝目標3-5を達成するために、細胞を支援します。指向性進化に使用されたホストのうち、ビール酵母サッカロマイセス・セレビシエは、原核生物のカウンターパート6,7でそうでなければ利用できない複雑な真核生物タンパク質の機能発現のためのソリューションのレパートリーを提供しています。
細胞生物学研究で徹底的用い、この小さな真核生物のモデルは、指向進化8によって酵素を設計するための重要な特徴であるその全ての翻訳後修飾、操作および形質転換効率の容易さの点で多くの利点を有します。また、高周波S.における相同DNA組換えのその効率的なプルーフリーディング装置に結合されたセレビシエは、複雑な人工的な経路9-12への単一の酵素とは 異なるシステムの進化を促進する、 生体内でのライブラリの作成 および遺伝子アセンブリのための可能性の広い配列を開きます。私たちの研究室では、酵母における異なるリグニナーゼの分子進化（天然木の崩壊の際にリグニンの分解に関与する酸化還元酵素）13-14のためのツールと戦略を設計する過去十年間を費やしてきました。この通信では、我々は準備するための詳細なプロトコルとS.の画面変異体ライブラリーを提示します、簡単に他の多くの酵素に変換することができます-モデルflavooxidase、 -アリール-アルコールオキシダーゼ（AAO 15）のためセレビシエ 。酵母細胞装置16、によって支援：（相同di vivo でグループ化することによって、変異原性組織再結合過程モーフィング）プロトコルは、集束指向進化の方法を含みます培養液17中に分泌AAO活性を検出するために、フェントン反応に基づいて、ダ非常に敏感なスクリーニングアッセイ。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、我々はSに指向進化により酵素を設計するために我々の研究室で使用されるヒントやトリックのほとんどをまとめていますセレビシエ （例としてAAOを使用して）、彼らは単にここに記載の一般的な方法に従って、多くの他の真核生物の酵素系との使用に適合させることができるようになっています。
ライブラリの作成 の面では、モーフ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].
Materials
| 1. Culture media | |||
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39 |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| Cloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13 |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16 |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | 83400 | CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51 |
| Peptone | Difco | 211677 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09 |
| Uracil | Sigma Aldrich | U1128 | |
| Yeast Extract | Difco | 212750 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids | Difco | 291940 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. PCR Reactions | |||
| dNTP Mix | Agilent genomics | 200415-51 | 25 mM each |
| iProof High-Fidelity DNA polymerase | Bio-rad | 172-5301 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M8054 | CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91 |
| Taq DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | D4545 | For error prone PCR |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Plasmid linearization | |||
| BamHI restriction enzyme | New England Biolabs | R0136S | |
| Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9001S | |
| XhoI restriction enzyme | New England Biolabs | R0146S | |
| Gel Red | Biotium | 41003 | For staining DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4. FOX assays | |||
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F3754 | CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14 |
| Anysil Alcohol | Sigma Aldrich | W209902 | CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16 |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17 |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck Millipore | 1072090250 | FOX standard curve |
| Xylenol Orange disodium salt | Sigma-Aldrich | 52097 | CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62 |
| Agarose gel stuff | – | – | – |
| Agarose | Norgen | 28035 | CAS Nº 9012-36-6 |
| Gel Red | Biotium | 41003 | DNA analysis dye |
| GeneRuler 1Kb Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | DNA M.W. standard |
| Loading Dye 6x | Thermo Scientific | R0611 | |
| Low-melting temperature agarose | Bio-rad | 161-3112 | CAS Nº 39346-81-1 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5. Kits and cells | |||
| S. cerevisiae strain BJ5465 | LGC Promochem, Spain | ATTC 208289 | Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL |
| E. coli XL2-Blue competent cells | Agilent genomics | 200150 | For plasmid purification and amplification |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740,609,250 | DNA gel extraction |
| NucleoSpin Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740,588,250 | Column miniprep Kit |
| Yeast Transformation Kit | Sigma-Aldrich | YEAST1-1KT | Included DNA carrier (Salmon testes) |
| Zymoprep yeast plasmid miniprep I | Zymo research | D2001 | Plasmid extraction from yeast |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6. Plates | |||
| 96-well plates | Greioner Bio-One | 655101 | Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements) |
| 96-well plates | Greioner Bio-One | 655161 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
| 96-well plate lid | Greioner Bio-One | 656171 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
Riferimenti
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