진화 방법에 감독<em> 사카로 마이 세스 세레 비지에</em> : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

생체 내 고주파 DNA 상동 재조합에 결합 구성, 복제 및 돌연변이 라이브러리의 발현을 수반하는 처리를위한 응용 바이오 효소를 설계 할 때 사카 cerevisiae를 향하고 진화 매력적인 많은 장점을 제공한다. 여기서는 총 활성을 향상시키는 진균 아릴 알코올 산화 효소 (AAO)의 예에 기초하여 효모 및 화면 변이체 라이브러리를 제작하는 프로토콜을 제시한다. 두 단백질 세그먼트는 무작위 돌연변이에 의해 생체 내 DNA 재조합에 초점을 맞춘 지시 진화 하였다. 각 세그먼트의 측면에 50 ~ BP의 오버행 전체 자율적으로 복제하는 플라스미드에 초래하는 선형화 된 벡터에 AAO 융합 유전자의 정확한 재결합을 허용했다. 기능 AAO 변형 풍부 돌연변이 라이브러리는 S.에서 상영되었다 펜톤 반응을 이용한 고감도 높은 처리량으로 분석 cerevisiae의 상층 액. 의 일반적인 과정S.에서 라이브러리 건설 cerevisiae에 여분의 PCR 반응, 시험 관내 재조합 DNA 및 결찰 단계를 피하고, 여기에 설명 쉽게 많은 다른 진핵 유전자 발전에 적용될 수있다.

Introduction

감독 분자 진화는 효소 ^{1, 2를} 설계 할 수있는 강력하고 빠르고 안정적인 방법입니다. 비 자연에서 새로운 반응에, 새로운 기판에 작용 무작위 돌연변이, 재조합 및 검사, 효소의 개선 된 버전을 생성 할 수의 반복 라운드를 통해 환경, 또는 새로운 대사 ^{3-5 목표를} 달성하기 위해 셀을 지원한다. 직접 진화에 사용 된 호스트 사이에서, 맥주의 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 원핵 생물의 대응 ^6,7에서, 그렇지 않으면 사용할 수없는 복잡한 진핵 세포 단백질의 기능 발현을위한 솔루션의 레퍼토리를 제공합니다.

세포 생물학 연구에 철저 사용,이 작은 진핵 모델은 직접 진화 ^(8)에 의해 효소를 엔지니어링하는 중요한 특성입니다 모두 번역 후 변형, 조작 및 변환 효율의 용이성 측면에서 많은 장점을 가지고있다. 또한, 고주파S.에서 상동 DNA 재조합의 효율적인 증명 판독 장치에 연결 cerevisiae의 복잡한 인공 경로 ^9-12에 하나의 효소는 다른 시스템의 진화를 촉진, 생체 내에서 라이브러리 생성 및 유전자 조립을위한 가능성의 다양한 열립니다. 우리 연구소는 효모에서 다른 ligninases의 분자 진화 (천연 나무 붕괴시 리그닌의 분해에 관여하는 산화 환원 효소) ^{13 ~ 14를위한} 도구와 전략을 설계 지난 십을 보냈다. 이 통신에서 우리는 준비 S.에서 화면 돌연변이 라이브러리에 대한 자세한 프로토콜을 제시 모델 flavooxidase, 아릴 알코올 산화 효소 세레 비지에 (AAO ¹⁵⁾ -, 즉 쉽게 많은 다른 효소로 번역 할 수있다. 효모 전지 장치 ^(16), 도움을 (상동 생체 그룹화에 의한 돌연변이 유발 조직 된 재조합 과정 모핑) 프로토콜은 초점 지시 진화 방법을 포함한다배양액 ⁽¹⁷⁾ 내로 분비 AAO 활성을 검출하기 위해 펜톤 반응을 이용한 다 민감 스크리닝 분석법.

Protocol

1. 돌연변이 라이브러리 생성 선택 영역은 가능한 결정 구조 또는 상 동성 모델 (18)에 기초하여 계산 알고리즘의 도움으로 모핑을하여야한다. 여기에, 임의의 돌연변이와 재조합 (메트로 [α1] -Val109, Phe392 – Gln566), 고성능 PCR에 의한 유전자 (844 bp의)의 나머지를 증폭하는 동안 (그림 1)에 대한 새송이에서 AAO의 두 지역을 대상으로. 참고 : ?…

Representative Results

P.에서 AAO 속 eryngii는 리그닌을 공격 시작 H 2 O 2와 곰팡이 퍼 옥시다아제를 공급하는 세포 외 flavooxidase입니다. AAO의 두 세그먼트는 활성 및 S.에서의 발현을 향상시키기 위해서 모핑에 의해 집광 지향 진화 하였다 cerevisiae의 19. S.에 의해 숨겨 외국 효소에 관계없이 cerevisiae의 효모에서 돌연변이 라이브러리?…

Discussion

이 글에서, 우리는 팁과 트릭의 대부분은 S.의 감독 진화에 의해 효소를 엔지니어링하는 우리의 실험실에서 사용 요약 한 세레 비지에 (예를 들어 AAO 사용)들은 단순히 여기에 기술 된 일반적인 방법에 따라 많은 다른 진핵 효소 시스템과 함께 사용하도록 적응 될 수 있도록.

라이브러리 생성의 측면에서, 모핑 소개 ⁽¹⁶⁾ 변경되지 않은 단백질의 나머지 영…

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)