Направленный метод Эволюция<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em>: Mutant Создание и скрининг библиотеки
Summary
We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Направленный эволюция в Saccharomyces CEREVISIAE предлагает много привлекательных преимуществ при проектировании ферменты для биотехнологических приложений, процесс , который включает в себя строительство, клонированию и экспрессии мутантных библиотек, в сочетании с высокой частотой гомологичной рекомбинации ДНК в естественных условиях. Здесь мы приводим протокол для создания и библиотеки мутантных экрана у дрожжей, основанные на примере грибковой арил-спиртовой оксидазы (АОА), чтобы повысить его общую активность. Два сегмента белка были подвергнуты сфокусированного направленной эволюции путем случайного мутагенеза и ин виво рекомбинации ДНК. Заходами ~ 50 б.п. фланкирующих каждый сегмент позволил правильную сборку гена ААО-фьюжн в линеаризованный вектор, что приводит к полной автономно тиражирование плазмиды. Мутант библиотеки , обогащенные функциональными вариантами ААО подвергали скринингу в S. CEREVISIAE супернатанты с чувствительным анализом с высокой пропускной способностью на основе реакции Фентона. Общий процессбиблиотека строительство в S. CEREVISIAE описанные здесь , могут быть легко применены к эволюции многих других эукариотических генов, избегая дополнительных ПЦР – реакций, экстракорпоральное ДНК – рекомбинации и лигирования шаги.
Introduction
Направленный молекулярная эволюция представляет собой надежный, быстрый и надежный метод для разработки ферментов 1, 2. Через итеративных раундов случайной мутации, рекомбинации и скрининга, улучшенные варианты ферментов могут быть сформированы , которые действуют на новых субстратах, в новых реакций, в ненатуральных среды, или даже помочь клетке для достижения новых целей обмена веществ 3-5. Среди хостов , используемых в направленной эволюции, дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE пивовара предлагает репертуар решений для функциональной экспрессии сложных белков эукариот, которые никаким иным образом не прокариотических аналогов 6,7.
Используется исчерпывающе в исследованиях клеточной биологии, эта маленькая эукариотической модель имеет много преимуществ с точки зрения пост-трансляционных модификаций, легкость манипулирования и преобразования эффективности, все из которых являются важными чертами инженеру ферментов путем направленной эволюции 8. Кроме того, высокая частотагомологичной рекомбинации ДНК в S. CEREVISIAE в сочетании с его эффективным устройством корректура открывает широкий спектр возможностей для создания библиотеки и сборки генов в живом организме , способствуя эволюции различных систем от отдельных ферментов до сложных искусственных путей 9-12. Наша лаборатория провела прошедшее десятилетие разработки инструментов и стратегий для молекулярной эволюции различных ligninases в дрожжах (оксидоредуктаз , участвующие в деградации лигнина в процессе естественного распада древесины) 13-14. В этой связи, мы представляем подробный протокол для подготовки и экран мутантные библиотеки в S. CEREVISIAE для модели flavooxidase, -арил-спиртовой оксидазы (ААО 15) -, который может быть легко переведено на многие другие ферменты. Протокол включает в себя целенаправленный направленный метод эволюции (морфингом мутагенный Организованная Рекомбинация процесса гомологичной в естественных условиях Группировка) при содействии аппарата дрожжевых клеток 16, А.Н.да очень чувствительный метод скрининг – анализа , основанный на реакции Фентона с целью определения активности AAO секретируемый в культуральный бульон , 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы суммировали большинство советы и приемы используются в нашей лаборатории для конструирования ферментов с помощью направленной эволюции в S. CEREVISIAE ( с использованием Aao в качестве примера) , таким образом , что они могут быть адаптированы для использования с многими …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].
Materials
| 1. Culture media | |||
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39 |
| Bacto Agar | Difco | 214010 | |
| Cloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13 |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16 |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma-Aldrich | 83400 | CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51 |
| Peptone | Difco | 211677 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09 |
| Uracil | Sigma Aldrich | U1128 | |
| Yeast Extract | Difco | 212750 | |
| Yeast Nitrogen Base without Amino Acids | Difco | 291940 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. PCR Reactions | |||
| dNTP Mix | Agilent genomics | 200415-51 | 25 mM each |
| iProof High-Fidelity DNA polymerase | Bio-rad | 172-5301 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M8054 | CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91 |
| Taq DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | D4545 | For error prone PCR |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Plasmid linearization | |||
| BamHI restriction enzyme | New England Biolabs | R0136S | |
| Bovine Serum Albumin | New England Biolabs | B9001S | |
| XhoI restriction enzyme | New England Biolabs | R0146S | |
| Gel Red | Biotium | 41003 | For staining DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4. FOX assays | |||
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F3754 | CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14 |
| Anysil Alcohol | Sigma Aldrich | W209902 | CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16 |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17 |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck Millipore | 1072090250 | FOX standard curve |
| Xylenol Orange disodium salt | Sigma-Aldrich | 52097 | CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62 |
| Agarose gel stuff | – | – | – |
| Agarose | Norgen | 28035 | CAS Nº 9012-36-6 |
| Gel Red | Biotium | 41003 | DNA analysis dye |
| GeneRuler 1Kb Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | DNA M.W. standard |
| Loading Dye 6x | Thermo Scientific | R0611 | |
| Low-melting temperature agarose | Bio-rad | 161-3112 | CAS Nº 39346-81-1 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5. Kits and cells | |||
| S. cerevisiae strain BJ5465 | LGC Promochem, Spain | ATTC 208289 | Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL |
| E. coli XL2-Blue competent cells | Agilent genomics | 200150 | For plasmid purification and amplification |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740,609,250 | DNA gel extraction |
| NucleoSpin Plasmid Kit | Macherey-Nagel | 740,588,250 | Column miniprep Kit |
| Yeast Transformation Kit | Sigma-Aldrich | YEAST1-1KT | Included DNA carrier (Salmon testes) |
| Zymoprep yeast plasmid miniprep I | Zymo research | D2001 | Plasmid extraction from yeast |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6. Plates | |||
| 96-well plates | Greioner Bio-One | 655101 | Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements) |
| 96-well plates | Greioner Bio-One | 655161 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
| 96-well plate lid | Greioner Bio-One | 656171 | Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations) |
Riferimenti
- Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
- Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
- Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
- Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
- Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
- Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
- Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
- Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
- Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
- Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
- Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).
- Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
- Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
- Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
- Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
- Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
- Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
- Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
- Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .
- Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).
