Riktad evolution Method in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>: Mutant bibliotek Skapande och screening

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Riktad evolution i Saccharomyces cerevisiae erbjuder många attraktiva fördelar vid utformning av enzymer för biotekniska tillämpningar, en process som involverar konstruktionen, kloning och expression av mutantbibliotek, kopplad till hög frekvens homolog DNA-rekombination in vivo. Här presenterar vi ett protokoll för att skapa och bibliotek skärmen muterade i jäst baserat på exemplet med en svamp aryl-alkoholoxidas (AAO) för att förbättra sin totala verksamhet. Två proteinsegment utsattes för fokuserad riktad evolution genom slumpmässig mutagenes och in vivo DNA-rekombination. Överhäng av ~ 50 bp flankerande varje segment tillåts den korrekta återsammansättning av AAO-fusionsgenen i en linjäriserad vektor som ger upphov till en fullständig autonomt replikerande plasmid. Mutant bibliotek berikade med funktionella AAO varianter screenades i S. cerevisiae supernatanter med en känslig hög genomströmning analys baserad på Fenton reaktion. Den allmänna processen förbibliotekskonstruktion i S. cerevisiae beskrivs här kan tillämpas lätt att utvecklas många andra eukaryota gener, undvika extra PCR-reaktioner, in vitro-DNA-rekombination och ligering steg.

Introduction

Riktad molekylär evolution är en robust, snabb och tillförlitlig metod för att utforma enzymer ^{ett, två.} Genom upprepade omgångar av slumpmässig mutation, rekombination och screening, kan genereras förbättrade versioner av enzymer som verkar på nya underlag, i nya reaktioner i icke-naturliga miljöer, eller ens att hjälpa cellen att nå nya metabola mål ^3-5. Bland värdarna används i riktad evolution, erbjuder öljäst Saccharomyces cerevisiae en repertoar av lösningar för funktionellt uttryck av komplexa eukaryota proteiner som annars inte finns tillgängliga i prokaryota motparter ^6,7.

Används uttömmande i cellbiologiska studier, har denna lilla eukaryot modell många fördelar i form av post-translationella modifieringar, enkel manipulation och transformationseffektiviteten, som alla är viktiga egenskaper att konstruera enzymer genom riktad evolution ^8. Dessutom den höga frekvensenav homolog DNA-rekombination i S. cerevisiae kopplad till en effektiv apparat korrekturläsning öppnar ett brett utbud av möjligheter för biblioteks skapande och gensammansättning in vivo, främja utvecklingen av olika system från enstaka enzymer till komplexa artificiella vägar ^9-12. Vårt laboratorium har tillbringat det senaste decenniet utforma verktyg och strategier för molekylär evolution av olika ligninaser i jäst (oxidoreduktaser är involverade i nedbrytningen av lignin under trä sönderfall) ^13-14. I detta meddelande presenterar vi ett detaljerat protokoll för att förbereda och bibliotek skärmen muterade i S. cerevisiae för en modell flavooxidase, -aryl-alkoholoxidas (AAO ¹⁵⁾ -, som lätt kan översättas till många andra enzymer. Protokollet innebär en fokuserad-riktad evolution metoden (MORPHING: mutagen Organiserad Rekombination processen genom homolog di vivo gruppering) biträdd av jästcellen apparaten ^16, enda mycket känslig screeningsanalys baserad på Fenton-reaktion i syfte att detektera AAO aktiviteten utsöndras i odlingsbuljongen ^17.

Protocol

1. Mutant Library Construction Välj vilka regioner som skall utsättas för MORPHING med hjälp av beräkningsalgoritmer baserat på de tillgängliga kristallstruktur eller homologimodeller 18. Här riktar två regioner i AAO från kungsmussling för slumpmässig mutagenes och rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), medan förstärka resten av genen (844 bp) av hifi-PCR (figur 1). Obs: Flera segment kan studeras genom MORPHING i …

Representative Results

AAO från P. eryngii är ett extracellulärt flavooxidase som förser svamp peroxidaser med H2O 2 att börja attackera lignin. Två segment av AAO utsattes för fokuserad riktad evolution genom MORPHING i syfte att öka dess aktivitet och dess uttryck i S. cerevisiae 19. Oberoende av de utländska enzymer hyste av S. cerevisiae, den mest kritiska frågan när man konstruerar muterade bibliotek i jäst avser konstruktion av speci…

Discussion

I den här artikeln har vi sammanfattat de flesta av de tips och tricks som används i vårt laboratorium för att konstruera enzymer genom riktad evolution i S. cerevisiae (med AAO som ett exempel) så att de kan anpassas för användning med många andra eukaryota enzymsystem genom att helt enkelt följa den gemensamma metod som beskrivs här.

I termer av biblioteket skapande, är MORPHING ett snabbt en-pot metod för att införa och rekombinera slumpmässiga mutationer i små pro…

Materials

1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C-0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Agarose gel stuff	–	–	–
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1Kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem, Spain	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Plates
96-well plates	Greioner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greioner Bio-One	655161	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greioner Bio-One	656171	Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)