Миелоидный Выделение клеток из кожи мышей и Слив лимфатического узла После внутрикожной иммунизации с живой аттенуированной<em> Plasmodium</em> Спорозоиты
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Малярийной инфекции начинается , когда стадия спорозоитов плазмодия засевают в кожу млекопитающего – хозяина через укус комара. Высоко подвижны паразит не только попадает в печень, чтобы вторгнуться в гепатоциты и превращаются в эритроцитах-инфекционный форму. Он также мигрирует в кожу и проксимального лимфатических узлов, дренирующих место инъекции, где он может быть признан и деградировал резидентом и / или завербованных миелоидных клеток. Прижизненные изображения сообщалось раннее набор ярко флуоресцентный Lys-GFP положительных лейкоцитов в коже , а также взаимодействия между спорозоитов и CD11c + клеток в осушение лимфатических узлов. Мы представляем здесь эффективную процедуру для восстановления, выявления и перечисления миелоидной подмножеств клеток, которые набираются на кожу мыши и дренирующих лимфатических узлов следующие внутрикожной инъекции иммунизация дозы спорозоитов в мышиной модели. Фенотипическая характеристика с использованием многопараметрических проточной цитометрии обеспечиваетнадежный анализ для оценки ранних динамических клеточных изменений в ходе воспалительной реакции на Plasmodium инфекции.
Introduction
Малярия является одной из самых опасных инфекционных заболеваний в мире погибло более полумиллиона человек в год. Инфекция Plasmodium, возбудителя заболевания, начинается с фазы преэритроцитарных (PE). Во время этой фазы, спорозоиты впрыскивается в принимающей коже самкой малярийного комара достигают печени через кровь и дифференцировать внутри гепатоцитов в формы паразитов , которые инфицируют красные кровяные клетки и вызывают симптомы заболевания.
Стадии ПЭ плазмодия представляют собой привилегированный мишень для вакцинации против малярии. Действительно, живые ослабленные вакцины против этих стадий, таких как радиация ослабляется спорозоитов (RAS), генетически арестованные паразиты (GAP) или химиопрофилактики и спорозоиты (СКЗ) продемонстрировали свою способность защищать как от грызунов и человека 1-9 узлов. В модели с грызунами, большинство исследований по вакцинации проводятся с использованием внутривенного введения иммунизации, Которая является золотым стандартом с точки зрения защитной эффективности. Тем не менее, описание стадии кожи и важность кожи ассоциированного дренирования лимфатического узла (дина) в выявляя защиту изменилось наше восприятие фазы PE и подчеркнул важность внутрикожно инъекции. Прижизненной визуализации P. berghei спорозоиты вводится в кожу грызунов показало , что только ~ 25% посевного материала достигает печени через кровь. Оставшиеся ~ 75% распределяется между проксимальным дина (~ 15%) и кожи (~ 50%) 10,11, где небольшая часть может трансформировать и остаются живыми в течение нескольких недель в клетках кожи 12,13. Более того, последующие исследования описано , что создание эффективного защитного иммунитета после внутрикожной иммунизации в основном происходит в коже-дина, где активируются паразит специфические CD8 + Т – клетки, и лишь незначительно в селезенке или печени-dLNs 14,15.
В то время какбольшинство исследований сосредоточено на характеристике эффекторных клеток, замешанных в создании защитного иммунного ответа, гораздо меньше известно о судьбе живых ослабленных паразитов, инжектированных в кожу, в особенности их взаимодействия с врожденной иммунной системы. В частности, характеристика антиген-представляющих клеток , участвующих в антигенной паразит поглощения, обработки и представления на CD8 + Т – клеток , имеет решающее значение, зная , что РЕ приобретение антиген может происходить как в коже и DlN отсеков. Предыдущие исследования прижизненные визуализации описал ранний приток ярко флуоресцентный Lys-GFP – положительных клеток в коже после инфекционного укусе комара 16 в то время как ранние взаимодействия между спорозоитов и дендритные клетки наблюдались в дина 10,17. Совсем недавно было сообщено, что спорозоиты засеянные в коже комарами повышает моторику обоих дендритных и регуляторных Т-клеток в кожемышей, в то время как уменьшение количества антиген – представляющих клеток наблюдалась в дина 18.
Мы стремились выявить и количественно более точно лейкоцитарной подмножества , завербованных в коже и соответствующие дина, а также лица , взаимодействующие с паразитом следующие внутрикожной инъекции иммунизация дозы РАН 19. В этом контексте, мы выделили миелоидных клеток (CD45 + CD11b +) из обеих тканей и характеризуется субпопуляции интерес с помощью мульти = параметрической проточной цитометрии. В соответствии с иммунным ответом , описанной в ранней стадии Leishmania основной инфекции кожи 20, основной ответ хозяин спорозоитов инъекции состоит из последовательного набора полиморфноядерных нейтрофилов (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C INT) с последующим воспалительным моноцитов (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) , которые определяются на основе differentiаль экспрессия поверхностных маркеров Ly6G и Ly6C.
Здесь мы опишем протокол для выделения миелоидных клеток кожи мыши и дина следующие внутрикожные инъекции иммунизация дозы РАН, выделенных из инфицированных комаров слюнных желез. Воспроизводимые внутрикожные инъекции и обработки тканей являются критически важными шагами, чтобы количественно оценить фенотипические изменения инфильтрации популяции клеток в инфицированных тканях. Подход подробно описаны ниже обеспечивает надежный анализ для оценки кожи и DlN воспалительной реакции на паразита Plasmodium и может быть распространен на различных экспериментальных систем.
Protocol
Representative Results
Discussion
В перспективе крупномасштабной вакцинации людей , используя всю вакцину спорозоитов малярии, одной из главных задач по преодолению заключается в разработке оптимизированных маршрутов и способов введения паразита для обеспечения успешной иммунизации и защиты 24,25. В организме ч?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Patricia Baldacci, Ванесса Lagal и Сабин Thiberge для критического чтения, Ирина Добреску и Сабин Thiberge за помощь в съемке и Полин Formaglio для обучения в естественных изображений спорозоидной моторики в коже мыши. Мы также хотели бы поблагодарить Марека Szatanik и Центр по производству и Инфицирование Anopheles (Cepia-Institut Pasteur) для противомоскитной выращивания. Это исследование было поддержано исследовательским фондом и фондами AXA от Laboratoire d'Превосходство "интегративной биологии возникающих инфекционных болезней» (грант №. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
Riferimenti
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
