בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em> Plasmodium</em> Sporozoites
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
זיהום מלריה מתחיל כאשר בשלב sporozoite של Plasmodium הוא מחוסן לתוך העור של מארח יונק באמצעות עקיצת יתוש. הטפיל הניע מאוד לא רק מגיע הכבד לפלוש hepatocytes ולהפוך לצורה כדורית-זיהומיות. זה גם נודד לתוך העור כדי הלימפה הפרוקסימלי ניקוז באזור הזריקה, שם הוא יכול להיות מוכר מושפל על ידי תושב ו / או תאי מיאלואידית גייס. הדמית Intravital דיווחה על הגיוס המוקדם של לויקוציטים החיובי ליס-GFP ניאון בהיר בעור ואת יחסי הגומלין בין sporozoites ו CD11c + תאי הלימפה הניקוז. אנו מציגים כאן הליך יעיל להתאושש, לזהות למנות את תת תא מיאלואידית כי מגויסים על העור העכבר וניקוז בלוטת לימפה לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של sporozoites במודל בעכברים. זרימת אפיון פנוטיפי רבה פרמטרית באמצעות cytometry מספקתassay אמין להעריך שינויים הסלולר דינמיים מוקדם במהלך תגובה דלקתית לזיהום Plasmodium.
Introduction
מלריה היא אחת המחלות הזיהומיות הקטלניות בעולם, הרג יותר מחצי מיליון בני אדם בשנה. זיהום על ידי Plasmodium, הסוכן סיבתי של המחלה, מתחיל שלב טרום האריתרוציטים (PE). במהלך שלב זה, sporozoites מוזרק לתוך העור מארח ידי יתוש נקבת Anopheline להגיע הכבד דרך מחזור הדם ולבדל hepatocytes בתוך לצורות הטפילות המדביקים תאי דם אדומים ולגרום הסימפטומים של המחלה.
שלבי PE של Plasmodium מהווים יעד חסוי לחיסון נגד מלריה. אכן, לחיות חיסונים מוחלשים נגד בשלבים אלה, כגון sporozoites נחלש קרינה (RAS), טפילים נעצר גנטית (GAP) או chemoprophylaxis ו sporozoites (CPS) הוכיחו את יכולתם להגן הן מכרסמים ומארחים האנושי 1-9. במודל המכרסם, רוב מחקרי חיסון נערכים ניצול חיסון תוך ורידים, המהווה את תקן הזהב במונחים של יעילות מגן. עם זאת, התיאור של שלב עור ואת החשיבות של הבלוטה לימפה הניקוז הקשורים עור (DLN) ב לעורר הגנה השתנה התפיסה שלנו של שלב PE והדגיש את החשיבות של המסלול תוך-עורית של הזרקה. הדמיה Intravital של פ sporozoites berghei מוזרק לתוך העור של מכרסמים הראו כי רק ~ 25% של הבידוד מגיע הכבד דרך מחזור הדם. הנותרים ~ 75% מפיצה בין הפרוקסימלי DLN (~ 15%) ואת העור (~ 50%) 10,11, שבו חלק קטן יכול להפוך ולהישאר בחיים במשך שבועות בתוך תאי העור 12,13. יתר על כן, מחקרים מאוחרים יותר תיאר כי הקמת הגנה חיסונית יעילה לאחר חיסון intradermal בעיקר מתרחש בעור-DLN, שבו טפיל ספציפי תאי CD8 + T מופעלים, ורק באופן שולי בטחול או בכבד-dLNs 14,15.
בזמןרוב המחקרים התמקדו באפיון תא המפעיל המעורב בהקמה בתגובת מגן חיסון, הרבה פחות ידוע על גורלם של טפילי מוחלשים חיים מוזרקים לתוך העור, במיוחד יחסי הגומלין שלהם עם מערכת החיסון המולדת. בפרט, אפיון של תאי מציגי אנטיגן מעורבים ספיג אנטיגן הטפיל, עיבוד והצגה לתאי CD8 + T הוא בעלת חשיבות מכרעת, בידיעה כי רכישת אנטיגן PE יכולה להתרחש הוא בעור ותאי DLN. מחקרי הדמיה intravital הקודם תיאר נהירה מוקדם של תאים חיוביים במאור פלורסנט ליס-GFP בעור בעקבות עקיצת יתוש זיהומיות 16 תוך אינטראקציות מוקדם בין sporozoites ותאים דנדריטיים נצפו DLN 10,17. לאחרונה, זה כבר דווח כי sporozoites המחוסן בעור על ידי יתושים מגביר את תנועתיות של שני תאי T הדנדריטים ורגולטוריים בעורעכברים, בעוד מספר ירידה של תאים מציגי אנטיגן נצפתה DLN 18.
החוקרים ביקשו לזהות ולכמת ליתר דיוק תת לויקוציטים גייס בעור המקביל DLN כמו גם אלה אינטראקציה עם הטפיל לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של RAS 19. בהקשר זה, אנחנו מבודדים תאי מיאלואידית (CD45 + CD11b +) משני הרקמות ומאופיינות תת-אוכלוסיות של ריבית על ידי זרימה רבה = פרמטרית cytometry. עולה בקנה אחד עם התגובה החיסונית מתוארת בשלב המוקדם של דלקת עור גדולה שושנת יריחו 20, תגובת המארח העיקרית sporozoite הזרקת מורכב גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) ואחריו מונוציטים דלקתיים (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) אשר מזוהים על בסיס differentiביטוי אל של סמני משטח Ly6G ו Ly6C.
אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאי מיאלואידית מעור עכבר DLN לאחר הזרקת intradermal של מחסנת מינונים של RAS שחולצו מן בלוטות רוק יתוש נגועות. זריקות תוך-עורית לשחזור ועיבוד רקמה הם שלבים קריטיים לכמת שינויים פנוטיפי של הסתננות אוכלוסיית תאים בתוך רקמות נגועות. הגישה כמפורט להלן מספק assay אמין להעריך את העור לתגובה דלקתית DLN כדי טפיל Plasmodium ויכול להתארך עד מערכות ניסיוניות שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרספקטיבה של החיסון בקנה מידה גדול של בני אדם באמצעות חיסון למלריה sporozoite שלם, אחד האתגרים העיקריים להתגבר היא לפתח נתיבים אופטימיזציה ושיטות ממשל טפיל על מנת להבטיח חיסון מוצלח והגנה 24,25. אצל בני אדם, הערכת יעילות מגנה בתיווך הטפיל מוחלשים חיים (LAP) שבוצעה בעקב?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים פטרישיה Baldacci, ונסה Lagal ו סבין Thiberge לקריאה ביקורתית, אירינה Dobrescu ו סבין Thiberge לעזרה מצלם ופאולין Formaglio להוראה בתחום ההדמיה vivo של תנועתיות sporozoite בעור העכבר. כמו כן, אנו רוצים להודות מארק Szatanik ומרכז ייצור הזיהום של אנופלס (פסטר CEPIA-Institut) לגידול יתושים. מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר AXA וקרנות מן Laboratoire ד אקסלנס "לביולוגיה אינטגרטיבית של מתעוררים מחלות זיהומיות" (מענק לא. ANR-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
Riferimenti
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
