माउस त्वचा और draining लिम्फ नोड से माइलॉयड सेल अलगाव लाइव तनु के साथ intradermal टीकाकरण के बाद<em> प्लाज्मोडियम</em> स्पोरोजोएट्स
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
मलेरिया संक्रमण शुरू होती है जब प्लाज्मोडियम की बीजाणुज चरण एक मच्छर के काटने के माध्यम से एक स्तनधारी मेजबान की त्वचा में टीका है। अत्यधिक गतिशील परजीवी न केवल जिगर hepatocytes आक्रमण और एरिथ्रोसाइट संक्रामक रूप में परिणत करने के लिए पहुंचता है। यह भी त्वचा में और समीपस्थ लिम्फ नोड इंजेक्शन साइट है, जहां यह मान्यता प्राप्त है और निवासी और / या भर्ती माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा अपमानित किया जा सकता draining के लिए migrates। Intravital इमेजिंग त्वचा में चमकते फ्लोरोसेंट लिस-GFP सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स और स्पोरोजोएट्स और CD11c + draining लिम्फ नोड में कोशिकाओं के बीच बातचीत के प्रारंभिक भर्ती की सूचना दी। हम यहाँ, ठीक पहचान करने और माइलॉयड सेल सबसेट है कि माउस त्वचा के लिए भर्ती किया और एक murine मॉडल में स्पोरोजोएट्स की खुराक immunizing की अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद लिम्फ नोड draining हैं गणना करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। प्ररूपी लक्षण वर्णन का उपयोग कर बहु-पैरामीट्रिक से फ्लो प्रदान करता हैएक विश्वसनीय परख प्लाज्मोडियम संक्रमण को भड़काऊ प्रतिक्रिया के दौरान जल्दी गतिशील सेलुलर परिवर्तन का आकलन करने के लिए।
Introduction
मलेरिया दुनिया में घातक संक्रामक रोगों, प्रति वर्ष आधे से ज्यादा एक लाख लोग मारे गए में से एक है। प्लाज्मोडियम, रोग के कारण एजेंट द्वारा संक्रमण एक पूर्व एरिथ्रोसाइटिक (पीई) चरण से शुरू होता है। इस चरण के दौरान, एक महिला Anopheline मच्छर द्वारा मेजबान त्वचा में इंजेक्शन स्पोरोजोएट्स खून के माध्यम से जिगर तक पहुँचने और परजीवी रूपों है कि लाल रक्त कोशिकाओं को संक्रमित और रोग के लक्षण पैदा में अंदर hepatocytes अलग।
प्लाज्मोडियम की पीई चरणों विरोधी मलेरिया टीकाकरण के लिए एक विशेषाधिकार प्राप्त लक्ष्य प्रतिनिधित्व करते हैं। दरअसल, इस तरह के विकिरण तनु स्पोरोजोएट्स (आरएएस) के रूप में इन चरणों के खिलाफ तनु टीके, रहते हैं, आनुवंशिक रूप से गिरफ्तार कर लिया परजीवी (जीएपी) या रसायनरोगनिरोध और स्पोरोजोएट्स (सीपीएस) दोनों कृंतक और मानव मेजबान टीम 1-9 की रक्षा के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन किया है। कृंतक मॉडल में, सबसे टीकाकरण के अध्ययन नसों में टीकाकरण का उपयोग आयोजित की जाती हैंहै, जो सुरक्षात्मक प्रभावकारिता के संदर्भ में स्वर्ण मानक है। हालांकि, एक त्वचा चरण का विवरण और त्वचा से जुड़े draining लिम्फ नोड (DLN) संरक्षण जानने में के महत्व पीई चरण के बारे में हमारी धारणा बदल और इंजेक्शन की अंतर्त्वचीय मार्ग के महत्व पर जोर दिया है। पी के intravital इमेजिंग berghei स्पोरोजोएट्स मूषक की त्वचा में इंजेक्शन से पता चला है कि inoculum के केवल ~ 25% खून के माध्यम से जिगर तक पहुँचता है। शेष ~ 75% समीपस्थ DLN (~ 15%) और त्वचा (~ 50%) 10,11, जहां एक छोटे से अनुपात त्वचा कोशिकाओं 12,13 के अंदर सप्ताह के लिए बदल सकते हैं और जीवित रहने के बीच वितरित करता है। इसके अलावा, बाद में पढ़ाई वर्णित है कि अंतर्त्वचीय टीकाकरण के बाद प्रभावी सुरक्षा प्रतिरोधक क्षमता की स्थापना मुख्य रूप से त्वचा-DLN, जहां परजीवी विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे हैं में जगह लेता है, और केवल तिल्ली या जिगर-dLNs 14,15 में मामूली।
जबकिज्यादातर अध्ययनों सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की स्थापना में फंसा प्रेरक कोशिकाओं के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित किया है, बहुत कम, जीना तनु त्वचा में इंजेक्शन परजीवी के भाग्य के बारे में जाना जाता है, विशेष रूप से सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ उनकी बातचीत। विशेष रूप से, सीडी 8 + टी कोशिकाओं को परजीवी प्रतिजन तेज, प्रसंस्करण और प्रस्तुति में शामिल प्रतिजन कोशिकाओं पेश के लक्षण वर्णन, महत्वपूर्ण महत्व का है यह जानकर कि पीई प्रतिजन अधिग्रहण दोनों त्वचा और DLN डिब्बों में हो सकता है। पिछला intravital इमेजिंग अध्ययन एक संक्रामक मच्छर के काटने से 16 जबकि स्पोरोजोएट्स और वृक्ष के समान कोशिकाओं के बीच जल्दी बातचीत DLN 10,17 में मनाया गया के बाद त्वचा में चमकते फ्लोरोसेंट लिस-GFP सकारात्मक कोशिकाओं का एक प्रारंभिक बाढ़ का वर्णन किया। अभी हाल ही में यह बताया गया है कि मच्छरों द्वारा त्वचा में टीका स्पोरोजोएट्स की त्वचा में दोनों वृक्ष के समान और विनियामक टी कोशिकाओं की गतिशीलता बढ़ जाती हैचूहों, जबकि प्रतिजन कोशिकाओं की कमी नंबर DLN 18 में मनाया गया।
हम पहचान करने और अधिक ठीक ल्युकोसैट सबसेट त्वचा में भर्ती है और इसी DLN आरएएस 19 की खुराक immunizing की अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद परजीवी के साथ बातचीत के उन लोगों के रूप में अच्छी तरह से यों के उद्देश्य से। इस संदर्भ में, हम दोनों के ऊतकों से माइलॉयड कोशिकाओं (CD45 + CD11b +) पृथक और cytometry बहु = पैरामीट्रिक प्रवाह द्वारा ब्याज की उप-जनसंख्या होती है। प्रतिरक्षा लीशमैनिया प्रमुख त्वचा संक्रमण 20 के प्रारंभिक चरण में वर्णित प्रतिक्रिया के अनुरूप, इंजेक्शन बीजाणुज करने के लिए प्राथमिक मेजबान प्रतिक्रिया Polymorphonuclear न्यूट्रोफिल (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C पूर्णांक) भड़काऊ monocytes (CD45 + CD11b के बाद की एक लगातार भर्ती होते हैं + Ly6G – Ly6C +) जो differenti के आधार पर पहचाने जाते हैंLy6G और Ly6C सतह मार्कर के अल अभिव्यक्ति।
हम यहाँ माउस त्वचा से माइलॉयड कोशिकाओं को अलग करने और DLN आरएएस की खुराक संक्रमित मच्छर लार ग्रंथियों से निकाला immunizing की अंतर्त्वचीय इंजेक्शन के बाद के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अंतर्त्वचीय इंजेक्शन और ऊतक प्रसंस्करण संक्रमित ऊतकों के भीतर सेल की आबादी में घुसपैठ की प्ररूपी परिवर्तन यों के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। दृष्टिकोण नीचे विस्तृत एक विश्वसनीय परख प्लाज्मोडियम परजीवी के लिए त्वचा और DLN भड़काऊ प्रतिक्रिया का आकलन करने और विभिन्न प्रायोगिक प्रणाली के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक पूरी बीजाणुज मलेरिया वैक्सीन का उपयोग मनुष्य के लिए बड़े पैमाने पर टीकाकरण के परिप्रेक्ष्य में, मुख्य चुनौतियों पर काबू पाने का एक सफल टीकाकरण और सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए 24,25 अनुकूलित मार्…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों माउस त्वचा में बीजाणुज गतिशीलता के vivo इमेजिंग में शिक्षण के लिए चित्रों और पॉलीन Formaglio लेने में मदद के लिए पेट्रीसिया Baldacci, वैनेसा Lagal और सबीन Thiberge महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए, इरीना Dobrescu और सबीन Thiberge धन्यवाद। हम यह भी मच्छर के पालन के लिए उत्पादन और एनोफ़ेलीज़ (Cepia-Institut पाश्चर) के संक्रमण के लिए मारेक Szatanik और केंद्र को धन्यवाद देना चाहूंगा। इस अध्ययन एक्सा रिसर्च फंड और Laboratoire d'उत्कृष्टता "संक्रामक रोगों उभरते की एकीकृत जीवविज्ञान" से धन द्वारा समर्थित किया गया (अनुदान नहीं। ANR-10-LabX-62-IBEID)।
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
Riferimenti
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