약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em> 변형체</em> 포자 소체
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
변형체의 포자 소체 단계는 모기에 물린 통해 포유 동물 숙주의 피부에 접종 할 때 말라리아 감염이 시작됩니다. 고도의 운동성이 기생충뿐만 아니라 간세포에 침입 및 적혈구-감염 형태로 변환 할 수있는 간 도달한다. 또한 피부에 그것을 인식하고 상주 및 / 또는 보충 골수 세포에 의해 분해 될 수있는 주사 부위를 배출 근위 림프절로 이동한다. 생체 내에 영상은 밝은 형광리스-GFP 긍정적 인 피부 백혈구 및 배수 림프절의 포자 소체와의 CD11c + 세포 사이의 상호 작용의 초기 모집을보고했다. 우리는 여기서, 복구 식별하고 마우스 피부에 모집 및 쥐 모델에서 포자 소체의 용량을 면역의 피내 주사 다음과 림프절을 배출하는 골수 세포 하위 집합을 열거 할 수있는 효율적인 방법을 제시한다. 표현형 특성을 사용하여 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 제공신뢰할 수있는 분석은 말라리아 감염에 염증 반응시 초기 동적 세포 변화를 평가한다.
Introduction
말라리아는 매년 50 만 명이 사망 세계에서 가장 치명적인 전염병 중 하나입니다. 변형체, 질병의 원인 에이전트에 의한 감염은 미리 적혈구 (PE) 단계에 의해 시작된다. 이 단계에서, 여성 Anopheline 모기에 의해 숙주의 피부에 주입 포자 소체는 혈류를 통한 간 도달 질병의 증상을 적혈구를 감염 원인 기생충 형태로 내부 간세포 분화.
변형체의 PE 단계는 항 말라리아 예방 접종에 대한 권한이 대상을 나타냅니다. 실제로, 방사선 감쇠 포자 소체 (RAS) 이러한 단계에 대한 약독 화 백신, 살, 유전자 체포 기생충 (GAP) 또는 화학적 예방 및 포자 소체 (CPS)는 설치류와 인간의 호스트 1-9을 보호하기 위해 자신의 능력을 증명하고있다. 설치류 모델에서 대부분의 백신 연구는 정맥 내 면역화를 이용하는 실시하고보호 효과의 측면에서 황금 표준이되는 것입니다. 그러나, 피부 단계의 설명 및 보호를 유도에서 피부 – 관련 배수 림프절 (DLN)의 중요성은 PE상의 우리의 인식 변화와 주사 피내 경로의 중요성을 강조 하였다. P.의 생체 내에 영상 쥐의 피부에 주입 berghei의 포자 소체는 접종의 ~ 25 %가 혈류를 통해 간 도달 한 것을 도시하고있다. ~ 나머지 75 %는 작은 비율이 피부 세포 (12, 13)의 내부 주 동안 살아 변환하고 남아있을 수 근위 DLN (~ 15 %)과 피부 (~ 50 %) 10, 11, 사이에 분배한다. 또한, 후속 연구는 피내 접종 후 효과적인 보호 면역의 설립은 주로 기생충 특정 CD8 + T 세포가 활성화되어 피부 DLN에서 발생, 만 소폭 비장이나 간 dLNs 14, 15에 있음을 설명했다.
동안대부분의 연구는 보호 면역 반응의 확립에 연루 이펙터 세포의 특성에 집중 한 덜은 선천성 면역계와의 상호 작용, 특히 피부에 주입 약독 기생충의 운명에 대해 공지되어있다. 특히, CD8 + T 세포 기생충 항원 흡수, 처리 및 표시에 관련된 항원 제시 세포의 특성화 PE 항원 취득 피부 DLN 구획 모두에서 발생할 수 있다는 것을 아는 것은 매우 중요하다. 이전 생체 내에 이미징 연구는 포자 소체와 수지상 세포 사이의 초기 상호 작용이 DLN 10,17에서 관찰하는 동안 감염 모기에 물린 16 다음 피부에 밝은 형광리스-GFP 양성 세포의 초기 유입을 설명했다. 더 최근에는 모기에 의해 피부에 접종하여 포자 소체가 피부에 모두 돌기 규제 T 세포의 운동성을 증가시키는 것으로보고되어있다마우스, 항원 제시 세포의 감소 된 수는 18 DLN 관찰하면서.
우리는 더 정확하게 식별하고, 백혈구의 서브 세트에 피부에 모집 RAS (19)의 투여가 면역 피내 주사 다음 기생충과 상호 작용하는 것과 같이 잘 DLN 대응 정량화 목적. 이러한 맥락에서, 우리는 모두 조직에서 골수 세포 (CD45 + CD11b를 +)를 분리하고 세포 계측법 = 다중 매개 변수 흐름에 의해 관심의 개체군을 특징으로한다. 슈만 편모충 주요 피부 감염 (20)의 초기 단계에 설명 된 면역 반응과 일치, 분사를 포자 소체하는 기본 호스트 응답은 염증성 단핵 세포 (CD45 + CD11b를 다음 다형 핵 호중구 (CD45 + CD11b를 + Ly6G + Ly6C의 INT)의 연속 모집으로 구성 + Ly6G – differenti에 기초하여 식별 Ly6C +)Ly6G 및 Ly6C 표면 마커의 알 식입니다.
우리는 마우스 피부에서 골수 세포를 분리하고 DLN 감염된 모기의 침샘에서 추출 RAS의 용량을 면역의 피내 주사를 다음 여기 프로토콜을 설명합니다. 재현 피내 주사 및 조직 처리는 감염된 조직 내에서 세포 인구 침투의 표현형 변화를 정량화하는 중요한 단계이다. 아래에 설명 된 접근 방식은 신뢰성있는 분석은 말라리아 기생충의 피부 DLN 염증 반응을 평가하기 위해 각종 실험 시스템으로 확장 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전체 포자 소체 말라리아 백신을 사용한 인간의 대규모 예방의 관점에서 극복하는 주요 문제점 중 하나는 성공적인 면역 보호 (24, 25)을 위해 최적화 된 경로와 기생충 투여 방법을 개발하는 것이다. 인간에서, 약독 기생충 (LAP)에 의해 매개되는 예방 효과의 평가는 다음 천연 모기 수행 된 2뿐만 아니라, 피내, 피하 25, 26 및 27 IV 면역 물린. 설치류 (28) 및 비 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 마우스 피부에 포자 소체의 운동의 생체 내 이미징에서 교육에 대한 사진과 바울 Formaglio을 복용에 도움을 패트리샤 Baldacci, 바네사 Lagal과 사빈 Thiberge 중요한 읽기, 이리나 Dobrescu 보낸 및 사빈 Thiberge 감사합니다. 우리는 또한 모기 양육에 대한 생산 및 아노 펠 레스 (CEPIA – 파스퇴르 연구소)의 감염에 대한 마렉 Szatanik와 센터를 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는의 Laboratoire 디부 우수상 "전염병을 신흥의 통합적인 생물학"에서 AXA 연구 기금과 기금에 의해 지원되었다 (아니. ANR-10 LabX에-62-IBEID을 부여).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
Riferimenti
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