Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em> Plasmodium</em> Esporozoítos
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Infecção da malária começa quando a fase de esporozoíto do Plasmodium é inoculada na pele de um mamífero hospedeiro através de uma picada de mosquito. O parasita altamente móveis não só atinge o fígado para invadir hepatócitos e se transformar em forma de eritrócitos-infeccioso. É também migra para a pele e para o nó de linfa de drenagem proximal do local de injecção, onde pode ser reconhecido e degradado por residente e / ou células mielóides recrutados. Imagens intravital informou o recrutamento precoce de leucócitos positivos brilhantemente fluorescente Lys-GFP na pele e as interações entre os esporozoítos e CD11c + células do linfonodo de drenagem. Nós apresentamos aqui um procedimento eficiente para recuperar, identificar e enumerar as subpopulações de células mielóides que são recrutados para a pele do rato e drenagem dos linfonodos após a injecção intradérmica de doses imunizantes de esporozoítos num modelo murino. Caracterização fenotípica utilizando fluxo multi-paramétrico fornece citometriaum ensaio fiável para avaliar alterações precoces celulares dinâmicas durante a resposta inflamatória à infecção por Plasmodium.
Introduction
A malária é uma das mais mortais doenças infecciosas no mundo, matando mais de meio milhão de pessoas por ano. A infecção pelo Plasmodium, o agente causador da doença, começa por uma fase de pré-eritrocítico (PE). Durante esta fase, os esporozoitos injectados na pele hospedeiro por um mosquito fêmea Anofelíneos atingir o fígado através da corrente sanguínea e diferenciam hepatócitos no interior para as formas de parasitas que infectam as células vermelhas do sangue e causam os sintomas da doença.
Os estágios PE de Plasmodium representar um alvo privilegiado para a vacinação anti-malária. Na verdade, vacinas vivas atenuadas contra essas etapas, tais como radiação atenuada esporozoítos (RAS), parasitas geneticamente presos (GAP) ou quimioprofilaxia e esporozoítos (CPS) demonstraram a sua capacidade para proteger tanto de roedores e hospedeiros humanos 1-9. No modelo de roedores, a maioria dos estudos de vacinação são conduzidas utilizando imunização intravenosa, Que é o padrão ouro em termos de eficácia protetora. No entanto, a descrição de uma etapa da pele e a importância do linfonodo de drenagem associada à pele (DLN) na indução de protecção mudou nossa percepção da fase de PE e enfatizou a importância da via intradérmica da injeção. Imagiologia intravital de P. esporozoítos berghei injectados na pele de roedores tem mostrado que apenas ~ 25% do inoculo atinge o fígado através da corrente sanguínea. Os restantes 75% ~ distribui entre o DLN proximal (~ 15%) e a pele (~ 50%) 10,11, onde uma pequena parte pode transformar e permanecer vivo por semana no interior das células da pele 12,13. Além disso, estudos subsequentes descrito que o estabelecimento de imunidade protetora eficaz após a imunização intradérmica ocorre principalmente na pele ed-Din, onde as células T CD8 + específicas do parasita são ativadas, e apenas marginalmente no baço ou fígado-dLNs 14,15.
Enquantoa maioria dos estudos têm-se concentrado sobre a caracterização das células efectoras implicadas no estabelecimento da resposta imunitária protectora, muito menos se conhece sobre o destino de parasitas vivos atenuados injectados para dentro da pele, em especial as suas interacções com o sistema imune inato. Em particular, a caracterização das células apresentadoras de antigénios envolvidos na captação de antigénio parasita, processamento e apresentação a células T CD8 + é de importância crítica, sabendo que a aquisição antigénio PE pode ocorrer tanto na pele e compartimentos DLN. Estudos prévios de imagens intravital descrito um influxo precoce de células positivas brilhantemente fluorescentes Lys-GFP na pele após uma picada de mosquito infecciosa 16 enquanto primeiros interacções entre os esporozóitos e células dendríticas foram observados no DLN 10,17. Mais recentemente, foi relatado que os esporozoitos inoculados na pele por mosquitos aumenta a motilidade de ambas as células T reguladoras dendríticas e na pele deratinhos, enquanto que um número de diminuição de células apresentadoras de antigénio foi observada no DLN 18.
Nós teve como objetivo identificar e quantificar mais precisamente os subconjuntos de leucócitos recrutados na pele e DLN correspondentes, bem como aqueles interagindo com o parasita após a injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS 19. Neste contexto, foram isoladas células mielóides (CD45 + CD11b +) de ambos os tecidos e caracterizada subpopulações de interesse pelo multi = fluxo paramétrico citometria. Consistente com a resposta imune descrito no estádio precoce de parasita Leishmania major infecção da pele 20, a resposta do hospedeiro primário de esporozoíto de injecção consiste de um recrutamento sucessiva de neutrófilos polimorfonucleares (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguido por monócitos inflamatórios (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +), que são identificadas com base na diferenciaramexpressão al dos marcadores de superfície Ly6G e Ly6C.
Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mielóides a partir da pele do rato e DLN após injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS extraídos de glândulas salivares do mosquito infectados. injecções intradérmicas reprodutíveis e processamento de tecidos são passos fundamentais para quantificar alterações fenotípicas de infiltração população de células nos tecidos infectados. A abordagem detalhado abaixo proporciona um ensaio fiável para avaliar a resposta inflamatória da pele e para DLN parasita Plasmodium e pode ser alargado a vários sistemas experimentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na perspectiva de vacinação em larga escala de seres humanos usando uma vacina de esporozoíto da malária conjunto, um dos principais desafios para superar é desenvolver vias e métodos de administração parasita optimizadas para assegurar uma imunização bem sucedida e protecção 24,25. Nos seres humanos, a avaliação da eficácia protectora mediada por parasitas vivos atenuados (LAP) foi realizada seguindo natural mosquito morde 2, bem como intradérmica, subcutânea e 25,26 IV…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge para a leitura crítica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge ajuda para tirar fotos e Pauline Formaglio para o ensino em imagem in vivo da motilidade esporozoítos na pele do rato. Nós também gostaríamos de agradecer Marek Szatanik e do Centro de Produção e Infecção do Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para a criação do mosquito. Este estudo foi apoiado pelo Fundo AXA Pesquisa e fundos do Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa de Doenças Infecciosas Emergentes" (conceder nenhuma. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
Riferimenti
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