Myeloid cellisolering från mushud och dränerande lymfkörteln Efter Intradermal immunisering med levande försvagade<em> Plasmodium</em> Sporozoiter
Summary
We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Abstract
Malariainfektion börjar när sporozoit stadiet av Plasmodium ympas in i huden hos en däggdjursvärd genom ett myggbett. Den mycket rörliga parasiten inte bara når levern att invadera hepatocyter och förvandlas till erytrocyt-infektiösa formen. Det migrerar också in i huden och den proximala lymfkörteln dränering av injektionsstället, där det kan kännas igen och bryts ned av inhemska och / eller rekryterade myeloidceller. Intravital avbildning rapporterade tidigt rekrytering av ljust fluorescerande Lys-GFP positiva leukocyter i huden och samspelet mellan sporozoiter och CD11c + celler i dränerande lymfkörteln. Vi presenterar här ett effektivt förfarande för att återhämta sig, identifiera och räkna de myeloida cellgrupper som rekryteras till mushud och dränerande lymfkörteln efter intradermal injektion för immunisering doser av sporozoiter i en musmodell. Fenotypisk karaktärisering med hjälp av multi-parametrisk flöde ger cytometryen tillförlitlig analys för att bedöma tidiga dynamiska cellförändringar under inflammatoriska svaret på Plasmodium infektion.
Introduction
Malaria är en av de dödligaste infektionssjukdomar i världen och dödade mer än en halv miljon människor per år. Infektion av Plasmodium, det orsakande medlet av sjukdomen, börjar med en pre-erytrocyt (PE) fas. Under denna fas, sporozoiter injicerade in i värd huden genom en kvinnlig Anopheline mygga når levern via blodströmmen och differentieras inne hepatocyter in i parasitformer som infekterar röda blodkroppar och orsaka symptomen på sjukdomen.
PE stadier av Plasmodium utgör en privilegierad mål för anti-malaria vaccination. Faktum är levande försvagade vacciner mot dessa stadier, såsom strålning dämpas sporozoiter (RAS), har genetiskt gripits parasiter (GAP) eller kemoprofylax och sporozoiter (CPS) visat sin förmåga att skydda både gnagare och mänskliga värdar 1-9. I gnagare modell, de flesta vaccinationsstudier genomfördes med användning av intravenös immunisering, Vilket är den högsta standarden när det gäller skyddande effekt. Däremot har beskrivningen av en hud skede och vikten av huden associerade dränerande lymfkörteln (DLN) för att framkalla skydd ändrat vår uppfattning av PE-fasen och betonade vikten av intradermalt injektionsstället. Intravital avbildning av P. berghei-sporozoiter injicerade in i huden hos gnagare har visat att endast ~ 25% av inokulatet når levern via blodomloppet. De återstående ~ 75% fördelas mellan den proximala DLN (~ 15%) och huden (~ 50%) 10,11, där en liten del kan förändra och förblir levande för veckor i hudceller 12,13. Dessutom senare studier beskrev att inrättandet av en effektiv skyddande immunitet efter intradermal immunisering sker främst i huden-DLN, där parasit specifika CD8 + T-celler aktiveras och endast marginellt i mjälten eller levern-DLN-er 14,15.
Medande flesta studier har koncentrerat sig på karaktärisering av effektorceller inblandade i upprättandet av skyddande immunsvar, är mycket mindre känt om ödet för levande försvagade parasiter injiceras i huden, särskilt deras interaktion med det medfödda immunförsvaret. I synnerhet, är karakterisering av antigenpresenterande celler som är involverade i parasitantigenupptag, bearbetning och presentation till CD8 + T-celler av avgörande betydelse, att veta att PE-antigen förvärv kan förekomma både i huden och DLN fack. Tidigare intravital imaging studier beskrev ett tidigt inflöde av ljust fluorescerande Lys-GFP-positiva celler i huden efter en smittsam myggbett 16 medan tidiga växelverkan mellan sporozoiter och dendritiska celler observerades i DLN 10,17. På senare tid har det rapporterats att sporozoiter inympade i huden av myggor ökar rörligheten både dendritiska och regulatoriska T-celler i hudenmöss, medan en minskning antalet antigenpresenterande celler observerades i DLN 18.
Vi syftar till att identifiera och kvantifiera mer exakt leukocyter delmängder rekryteras i huden och motsvarande DLN liksom de interagerar med parasiten efter intradermal injektion för immunisering doser av RAS 19. I detta sammanhang, isolerade vi myeloidceller (CD45 + CD11b +) från både vävnader och kännetecknas subpopulationer av intresse genom flera = parametrisk flödescytometri. I överensstämmelse med immunsvaret beskrivs i ett tidigt skede av Leishmania major hudinfektion 20, den primära värden svar på sporozoit injektion består av en successiv rekrytering av polymorfonukleära neutrofiler (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) följt av inflammatoriska monocyter (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +) som identifieras på grundval av differential uttryck av de Ly6G och Ly6C ytmarkörer.
Vi beskriver här ett protokoll för att isolera myeloidceller från mus hud och DLN efter intradermal injektion för immunisering doser av RAS extraherade från infekterade myggor spottkörtlar. Reproducerbara intradermala injektioner och vävnadsbehandling är viktiga steg för att kvantifiera fenotypiska förändringar av infiltrerande cellpopulation inom infekterade vävnader. Det tillvägagångssätt som beskrivs i detalj nedan ger en tillförlitlig analys för att bedöma den hud och DLN inflammatoriska svaret på Plasmodium parasit och kan utvidgas till olika experimentella system.
Protocol
Representative Results
Discussion
I perspektivet av storskalig vaccinering av människor som använder en hel sporozoit malariavaccin, är en av de största utmaningarna att övervinna för att utveckla optimerade rutter och metoder för parasit förvaltningen för att säkerställa framgångsrik immunisering och skydd 24,25. Hos människor, har utvärderingen av skyddande effekt medieras av levande försvagade parasiter (LAP) utförts efter naturlig myggbett 2, såväl som intradermal, subkutan 25,26 och IV immunisering…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Patricia Baldacci, Vanessa Lagal och Sabine Thiberge för kritisk läsning, Irina Dobrescu och Sabine Thiberge för hjälp med att ta bilder och Pauline Formaglio för undervisning in vivo avbildning av sporozoit rörlighet i mushud. Vi vill också tacka Marek Szatanik och Centrum för Produktion och infektion av Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) för mygga uppfödning. Denna studie stöddes av AXA Research Fund och medel från Laboratoire d'Excellence "integrativ biologi av Emerging Infectious Diseases" (bevilja nr. ANR-10-LABX-62-IBEID).
Materials
| Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
| Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
| NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
| Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
| MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
| 70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
| 2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
| BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
| BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
| 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
| DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
| DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500 | – |
| HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
| Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
| Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
| Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
| Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |
Riferimenti
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al. Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites. J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).
- Mueller, A. K., et al. Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).
- Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schlüter, D. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).
- van Dijk, M. R., et al. Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).
- Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites. Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).
- Belnoue, E., et al. Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment. J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).
- Behet, M. C., et al. Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum. Malar J. 13, 136 (2014).
- Amino, R., et al. Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal. Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).
- Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site. Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).
- Gueirard, P., et al. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).
- Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection. Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).
- Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes. Nat Med. 13 (9), (2007).
- Obeid, M., et al. Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria. EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).
- Amino, R., et al. Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver. Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).
- Radtke, A. J., et al. Lymph-node resident CD8α+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses. PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).
- da Silva, H. B., et al. Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites. Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).
- Mac-Daniel, L., et al. Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin. J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).
- Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response. PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).
- Thiberge, S., et al. In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver. Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).
- Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell. Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).
- Amino, R., et al. Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host. Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).
- Ploemen, I. H., et al. Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents. Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Roestenberg, M., et al. Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study. Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).
- Seder, R. A., et al. Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine. Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).
- Douradinha, B., et al. Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection. Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J Vis Exp. (63), e4040 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).
