Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle
Summary
We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.
Abstract
The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.
Introduction
Obwohl genetische Austausch zwischen zwei das zentrale Ereignis in der sexuellen Fortpflanzung ist es, Zellen, stützt sie sich auf eine Kette von Ereignissen, die Zelldifferenzierung fördern, ermöglichen die Partnerwahl durchführen Zell-Zell-Fusion und genomische Stabilität aufrechtzuerhalten. So ist die sexuelle Lebenszyklus selbst als Modellsystem stellt eine Reihe von biologischen Fragen in Bezug auf Entwicklungs Schalter, als Reaktion auf extrinsische Reize, Plasmamembranfusion, die Chromosomensegregation zu studieren, usw. Erforschung der Spalthefe Sexualzyklus , diese Phänomene zu studieren , bringt die Vorteile der Modellsystem leistungsstarke Genetik, gut etablierte High-Throughput-Ansätze und anspruchsvolle Mikroskopie. Sex in Spalthefe ist ein heterotypic Ereignis zwischen einer P-Zelle und einer M-Zelle von unterschiedlichen Paarungstypen. Die beiden Zelltypen differentiell eine Reihe von Genen 1,2 einschließlich der für die Produktion des sekretierten P- und M-Pheromonen, Pheromon-Rezeptoren Map3 und MAM2 sowie Pheromon-protea auszudrückenses Sxa1 und Sxa2. Homothallischen Stämmen wie den H90 – Stamm häufig verwendet, tragen die genetische Information für beide Paarungstypen in einem einzigen Genom und Zellen durchlaufen ein komplexes Muster von Paarungstyp Schalt ganzen Lebenszyklus mitotische ( zusammengefasst in Ref. 3). Mehrere Isolate von heterothallisch Spalthefe , die selten oder nie Paarungstyp wechseln werden auch häufig 4, am deutlichsten die h + N (P-Typ) und h -S (M-Typ) Stämme verwendet.
In Spalthefe, Eintritt in den sexuellen Lebenszyklus ist unter strengen Ernährungs Regulierung. Nur verhaften Stickstoff verhungert Spalthefezellen mitotischen Reproduktion und produzieren diffusionsfähig Pheromone Anwesenheit eines Paarungspartner zu signalisieren , und weitere Schritte des Sexualzyklus fördern ( beschrieben in Ref. 5). Stickstoffentzug de-reprimiert den Schlüssel Transkriptionsregulator der Paarung Ste11, die als Entwicklungs Schalter wirkt und fördert expression spezifischer Gene einschließlich des Pheromon – Rezeptor – Paarung und dem Pheromon Produktion Gene 6,7. Pheromon-Rezeptor Engagement aktiviert den Rezeptor-gekoppelten Protein G-alpha und Downstream – MAPK – Signalisierung , die eine weitere Verbesserung Ste11 Transkriptionsaktivität 8-10, somit Pheromonproduktion in einer positiven Rückkopplung zwischen Paarungspartner zu erhöhen. Pheromone Ebenen sind von entscheidender Bedeutung verschiedener Zellpolarisationszustände zu induzieren , indem die Master – Organisator der Zellpolarität Regulierung der Rho-Familie GTPase Cdc42 11. Bei Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen Pheromon ist aktiv Cdc42 in dynamischen patches visualisiert der Zellperipherie Erkundung und kein Zellwachstum in diesem Stadium beobachtet werden. Erhöhte Pheromon Ebenen, um die Stabilisierung der Cdc42-Aktivität zu einer einzigen Zone und das Wachstum eines polarisierten Projektion fördern, zu bezeichnen die shmoo, die Partnerzellen in Kontakt bringt. Anschließend verschmelzen die beiden haploiden Paarungspartnern einen diploiden Zygote zu bilden. Die jüngsten Arbeiten zeigt the Existenz eines neuartigen Aktin Struktur essentiell für die Fusion, die durch die Paarung induzierten formin Fus1 12 zusammengebaut ist. Dieses Fusions Fokus konzentriert Typ-V – Myosin abhängige Prozesse und positioniert die Abbaumaschinen Zellwand, wodurch Remodellierung der Zellwand ermöglicht 12 Plasmamembran Kontakt ohne Zell – Lyse zu ermöglichen. Bei der Zell-Zell-Fusion, kommen die Kerne in Kontakt und Karyogamie unterziehen. Ein prominentes dynein abhängigen Hin- und Her – Bewegung des Kerns in der Zygote (die Pferdeschwanzbewegung) fördert dann die Paarung von Chromosom Homologe 13,14, die durch Meiose folgt. Schließlich werden die vier Produkte der Meiose in einzelne Sporen während der Sporulation verpackt.
Aufgrund seiner Komplexität und der zahlreichen Schritte, die eine detaillierte Überwachung der Paarung wurde herausfordernd. Zwei bemerkenswerte Schwierigkeiten sind, dass der gesamte Prozess dauert mehr als 15 Stunden und die Zellen sind schwierig zu synchronisieren. Diese difficulties werden durch Einzelzell-Mikroskopie Ansätze umgangen. Hier ein allgemeines Protokoll der sexuellen Lebenszyklus in Spalthefe zu untersuchen, wird präsentiert. Mit kleineren Anpassungen, dieses Protokoll die Studie über die verschiedenen Schritte des Verfahrens ermöglicht, nämlich die Induktion von Paarungs Genprodukts, Zellpolarisation und Paarung zwischen Schwester-Zellen nach der Paarungstyp Schalten und zwischen Nicht-Schwester Partner, Zell-Zell-Fusion, und nach der Fusion Pferdeschwanzbewegung, Meiose und Sporulation. Dieses Verfahren ermöglicht auf 1) leicht sichtbar fluoreszent markierte Proteine im Laufe der Zeit vor, während und nach der Fusion; 2) unterscheiden, die das Verhalten von Zellen des entgegengesetzten Paarungstyps; und 3) messen und zu quantifizieren Parameter wie shmooing, Paarung, Fusion oder Sporulationseffizienz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Umweltbedingungen und Nährstoffverfügbarkeit insbesondere beeinflussen stark die Spalthefe Physiologie. Stickstoffmangel ist notwendig , um Engagement für die sexuelle Fortpflanzung und zunächst führt zu spektakulären Veränderungen in der mitotischen Zellzyklus – Progression (Ref. 21 und Abbildung 2). Bei Stickstoffentfernung aus exponentiell wachsenden Bevölkerung, bei Teilung der Zellgröße schnell abnimmt (2C) und die Mehrzahl der Zellen verhaften mitotischen Prog…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AV wurde durch ein EMBO langfristigen Postdoc-Stipendium unterstützt. Die Forschung im Labor Martin wird durch einen ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) und einer Schweizerischen National Science Foundation Grant (31003A_155944) zu SGM finanziert.
Materials
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Pantothenate | AppliChem | A2088,0025 | |
| Nicotinic Acid | AppliChem | A0963,0100 | |
| Inositol | AppliChem | A1716,0100 | |
| Biotin | AppliChem | A0967,0250 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2.6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Molybdenum oxide (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4.5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Citric Acid | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| Adenine Hemisulfat Salt, mini 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Vaseline | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Paraffin | Reactolab | 7005600 |
Riferimenti
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O. Genomewide identification of pheromone-targeted transcription in fission yeast. BMC Genomics. 7, 303 (2006).
- Klar, A. J. Lessons learned from studies of fission yeast mating-type switching and silencing. Annu Rev Genet. 41, 213-236 (2007).
- Beach, D. H., Klar, A. J. Rearrangements of the transposable mating-type cassettes of fission yeast. EMBO J. 3 (3), 603-610 (1984).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: how yeast cells do it. Open Biol. 3 (3), 130008 (2013).
- Mochizuki, N., Yamamoto, M. Reduction in the intracellular cAMP level triggers initiation of sexual development in fission yeast. Mol Gen Genet. 233 (1-2), 17-24 (1992).
- Sugimoto, A., Iino, Y., Maeda, T., Watanabe, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development. Genes Dev. 5 (11), 1990-1999 (1991).
- Kjaerulff, S., Lautrup-Larsen, I., Truelsen, S., Pedersen, M., Nielsen, O. Constitutive activation of the fission yeast pheromone-responsive pathway induces ectopic meiosis and reveals ste11 as a mitogen-activated protein kinase target. Mol Cell Biol. 25 (5), 2045-2059 (2005).
- Obara, T., Nakafuku, M., Yamamoto, M., Kaziro, Y. Isolation and characterization of a gene encoding a G-protein alpha subunit from Schizosaccharomyces pombe: involvement in mating and sporulation pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (13), 5877-5881 (1991).
- Toda, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Fission yeast genes that confer resistance to staurosporine encode an AP-1-like transcription factor and a protein kinase related to the mammalian ERK1/MAP2 and budding yeast FUS3 and KSS1 kinases. Genes Dev. 5 (1), 60-73 (1991).
- Bendezu, F. O., Martin, S. G. Cdc42 explores the cell periphery for mate selection in fission yeast. Curr Biol. 23 (1), 42-47 (2013).
- Dudin, O., et al. A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast. J Cell Biol. 208 (7), 897-911 (2015).
- Chikashige, Y., et al. Telomere-led premeiotic chromosome movement in fission yeast. Science. 264 (5156), 270-273 (1994).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Egel, R., Willer, M., Kjaerulff, S., Davey, J., Nielsen, O. Assessment of pheromone production and response in fission yeast by a halo test of induced sporulation. Yeast. 10 (10), 1347-1354 (1994).
- Tran, P. T., Marsh, L., Doye, V., Inoue, S., Chang, F. A mechanism for nuclear positioning in fission yeast based on microtubule pushing. J Cell Biol. 153 (2), 397-411 (2001).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Kitamura, K., Shimoda, C. The Schizosaccharomyces pombe mam2 gene encodes a putative pheromone receptor which has a significant homology with the Saccharomyces cerevisiae Ste2 protein. EMBO J. 10 (12), 3743-3751 (1991).
- Tanaka, K., Davey, J., Imai, Y., Yamamoto, M. Schizosaccharomyces pombe map3+ encodes the putative M-factor receptor. Mol Cell Biol. 13 (1), 80-88 (1993).
- Motegi, F., Arai, R., Mabuchi, I. Identification of two type V myosins in fission yeast, one of which functions in polarized cell growth and moves rapidly in the cell. Mol Biol Cell. 12 (5), 1367-1380 (2001).
- Sajiki, K., Pluskal, T., Shimanuki, M., Yanagida, M. Metabolomic analysis of fission yeast at the onset of nitrogen starvation. Metabolites. 3 (4), 1118-1129 (2013).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 557-562 (2003).
- Dyer, J. M., et al. Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site. Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).
- Beta, C., Bodenschatz, E. Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis. Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).
- Lee, S. S., et al. Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis. Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).
