Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fluorescens Time-lapse Imaging av Complete Published: February 28, 2016 doi: 10.3791/53863
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Biology, Lund University

ERRATUM NOTICE

Introduction

Streptomycetes er jord-bolig bakterier som er preget av en kompleks utviklingssyklus som involverer morfologisk differensiering fra en flercellet, nærings-scavenging mycel til sovende, unigenomic sporer 1-3.

Under gunstige vekstbetingelser, er en typisk Streptomyces spore begynner å spire ved ekstrudering av en eller to bakterie rør (figur 1). Disse rørene forlenges etter tips forlengelse og vokse til en forgrenet hyphal nettverk kjent som vegetative mycelium. Polar vekst og hyphal forgrening er regissert av den essensielle proteiner DivIVA. Denne kveil-kveil-protein er en del av et stort cytoplasmatisk kompleks kalt polarisome, som er avgjørende for innsetting av nye celle konvolutt materiale på forløpende spiss 4-7. Under vegetativ vekst, de hyphal filamenter bli compartmentalized av sjeldne dannelsen av såkalte kryss vegger 8. Dannelsen av disse kryss vegger re quires FtsZ, den tubulin-lignende cytoskeletal protein som er viktig for celledeling i de fleste bakterier 9. I Streptomyces, men disse vegetative tverrvegger ikke fører til innsnevring og celle-celleseparasjon og derfor myseliemassen forblir som et nettverk av sammenhengende syncytial kammere. Som svar på næringsbegrensning og andre signaler som ikke er godt forstått, antenne hyfer bryte vekk fra den vegetative mycelium og vokse opp i luften tre. Oppsetting av disse strukturene initierer den reproduktive fase av utviklingen, hvorunder lang multi-genomisk lufthyfer bli delt inn i en rekke like store unigenomic prespore kammere. Denne massive celledeling arrangementet er drevet av synkron innsnevring av flere FtsZ ringer innenfor enkelt sporogenic hyfer 2,10. Morfologiske differensiering er fullført ved utgivelsen av sovende, tykke vegger, pigmenterte sporer.

t "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 1
Figur 1:. Den Streptomyces livssyklus på faste medier Dette er en modell av livssyklusen basert på klassiske studier av S. coelicolor vokser på agarplater. Den cellulære utvikling av en spore begynner med dannelse av en eller to bakterie rør, som vokser med spiss forlengelse for å danne et nettverk av forgrenings hyfer. Polar vekst og forgrening av den vegetative hyfer er regissert av DivIVA (rød). Dannelsen av vegetative kryss vegger krever FtsZ (grønn). Som svar på nærings begrensninger og andre signaler, blir lufthyfer reist. Arrestasjonen av antenne vekst er tett koordinert med montering av en stige av FtsZ-ringer, som gir opphav til sporulation septa som compartmentalize den sporogenic hyfer i boks-aktig prespore avdelinger. Disse avdelingene sammen en tykk sporevegg og er til slutt released som modne pigmenterte sporer.

De viktigste utviklings hendelsene i Streptomyces livssyklus er godt karakteriseres 1,3. Men det er fortsatt mangelvare er cellebiologiske studier som benytter fluorescens time-lapse mikroskopi for å gi innsikt i de subcellulære prosessene som ligger til grunn differensiering, for eksempel protein lokalisering dynamikk, kromosom bevegelse og utviklingsmessig kontrollert celledeling. Lever-celle avbildning av Streptomyces utvikling har vært vanskelig på grunn av kompleksiteten av livssyklusen og de ​​fysiologiske egenskapene til organismen. Tidligere studier på vegetativ vekst og den innledende fasen av sporulation septumdannelse har ansatt oksygenpermeabel bilde kamre, eller agarose-støttet veksten av Streptomyces coelicolor på et mikroskop scenen 11-15. Disse fremgangsmåter er imidlertid begrenset av en rekke faktorer. Noen systemer bare tillate kortsiktig avbildning av cellevekst end fluorescerende proteiner før celler lider av utilstrekkelig oksygentilførsel eller vokse ut av fokalplanet på grunn av den tre-dimensjonale mønster av hyphal utvikling. I de tilfeller hvor langvarig avbildning er mulig, dyrking av cellene på agarose klosser grenser eksperimentelt fleksibilitet fordi cellene ikke kan utsettes for alternative vekst eller stressbetingelser, og bakgrunnsfluorescens fra mediet i agarose elektrodene sterkt begrenser muligheten til å overvåke svakere fluorescerende signaler.

Her beskriver vi en protokoll for live-cell imaging av komplette Streptomyces livssyklus med utmerket presisjon og følsomhet. Ved økende Streptomyces i et mikrofluid enhet som er koblet til en fluorescens Widefield mikroskop (figur 2), er vi nå i stand til å overvåke spiring, vegetativ vekst og sporulation septumdannelse over en periode på opptil 30 timer. Dette er mye lettere ved bruk av de nye modellorganisme Streptomyces venezuelae fordi det sporulates til nær ferdigstillelse i neddykket kultur og dermed over begrensning av den klassiske modellen arter S. coelicolor, som bare sporulates på faste medier 16-20. For å hjelpe visualisere vegetativ vekst og sporulation, vi co-express fluorescens-merket versjoner av cellen polaritet markør DivIVA og nøkkelen celledeling protein FtsZ.

Vi bruker et kommersielt tilgjengelig microfluidic enhet som har blitt ansatt for mykobakterier, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis og gjær 21-25. Systemet feller celler i et enkelt fokusplanet og muliggjør kontroll av kontinuerlig perfusjon av dyrkningsmedium fra forskjellige reservoarer. I den detaljerte protokollen kan vi dra nytte av denne funksjonen til å utsette S. venezuelae vegetative mycelium til en ernæringsmessig nedgiring for å fremme sporulation.

Protokollen derives er for levende celle avbildning av hele Streptomyces livssyklus, men alternative media forhold eller mikroskopinnstillinger kan velges hvis spesifikke utviklingsstadier er av spesiell interesse.

Figur 2
Figur 2: Skjematisk viser det eksperimentelle arbeidet-strømning. De tre viktigste trinnene som er beskrevet i protokollen vises. Først blir sporer og brukt medium fremstilt fra en stasjonær-fase-kultur. For det andre, blir de friske sporer lastet inn i et mikrofluidsystem og S. venezuelae avbildes gjennom hele dens utviklingsmessige livsløpet ved hjelp av en helautomatisk invertert mikroskop med en inkubasjon kammer for å opprettholde en optimal veksttemperatur. For det tredje er det time-lapse-serien fått analysert og behandlet ved hjelp av open-source programvare Fiji.

Protocol

1. Isolering av Fresh S. venezuelae Sporer og klargjøring av brukt dyrkingsmedium

  1. Vaksinere 30 ml Maltose-gjærekstrakt-maltekstrakt (MYM) medium, supplert med 60 mikroliter R2 sporelementløsning (TE), med 10 mL sporer av belastning SV60 [attB φ BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mcherry P ftsZ -ftsZ-ypet)]. For jevn vekst og sporulation av cellene, bruk en forbløffet kolbe eller en flaske som inneholder en fjær til å oppnå tilstrekkelig lufting.
  2. Kultur celler for 35-40 timer ved 30 ° C og 250 rpm.
  3. Undersøk cellene ved flytende montert fasekontrastmikroskopi. På dette punktet mycellfragmenter og sporer vil være synlig.
  4. Sentrifuger 1 ml celler i en table-top sentrifuger ved 400 xg i 1 min til pellet mycel og større cellefragmenter.
  5. Overfør ca 300 mL supernatant containing en suspensjon av sporer i et nytt 1,5 ml rør og holde på is. Hold de resterende dyrkingsmedium for trinn 1.7.
  6. Fortynn 1:20 i sporer MYM-TE (endelig konsentrasjon: 0,5-5 x 10 7 sporer / ml) og holder på is inntil det er behov (se trinn 2.3).
    Merk: Selv om den eksakte betingelsene som utløser sporulation i Streptomyces ikke blir forstått, bruker brukt MYM-TE medium, inkludert eventuelle ukjente ekstracellulære signaler fra en sporulerende kultur, stimulerer sporulation.
  7. Filter-sterilisere 10 ml gjenværende kulturmediet for å skaffe brukt MYM-TE som er fri for sporer og mycelial fragmenter. Bruke et sterilt 0,22 um sprøytefilter og overføring brukt MYM-TE til et sterilt 15 ml rør.
  8. Hold forberedt brukt MYM-TE i noen dager ved 4 ° C dersom flere eksperimenter med lignende vekstforhold skal gjennomføres.

2. Utarbeidelse av microfluidic Device

Merk: Hver mikrofluid plate gjør det mulig for opptil fire uavhengige forsøk som skal utføres. For å unngå forurensning av de ubrukte flyt kamre, bruke sterile løsninger og arbeidsvilkår når du setter opp et eksperiment.

  1. Fjern transportløsning fra microfluidic plate og skyll brønnene med sterilt MYM-TE.
  2. Tilsett 300 ul MYM-TE til fjord vel en og 300 ul brukt MYM-TE til brønner 2 til 6.
  3. Last 40 ul fortynnet sporer fra trinn 1,6 i cellen lasting vel 8 av lane "A" og forsegle manifolden til platen i henhold til produsentens anvisninger.
  4. Start MicroFluidics kontroll programvare, velger du riktig plate type og sette opp en flyt program for å prime strømningskanal og kultur kammeret ved å strømme medium fra innløps brønner 1-5 på 6 psi i 2 min per brønn.
  5. I MicroFluidics kontrollprogramvare, skaper en strømning protokoll for eksperimentet: strømmende MYM-TE fra innløps vel en i 6 timer for å tillate for spiring og vegetative vekst av cellene. Bytte omderetter til perfusjon av brukt MYM-TE fra brønn 2 til 5 for den gjenværende tiden av forsøket. I løpet av eksperimentet holde strømningstrykk konstant ved 6 psi (svarende til ca. 9 ul medium / time). Begynn flyt program etter trinn 3,5.

3. Sett opp av mikroskopet og Time-lapse Protocol

Merk: Denne metoden ble gjennomført på en fullt motorisert og automatisert invertert vidfelt mikroskop utstyrt med en sCMOS kamera, en metallhalogenlampe, en hardware autofokus, en scene holder for 96-brønners plater og et miljøkammer.

  1. Forvarme miljøkammeret til 30 ° C på forhånd, for å forhindre problemer med autofokus etter start av eksperimentet. Tiden som kreves avhenger av miljøkammeret brukes, mikroskop og varmesystemet. Begynn å varme opp systemet kvelden før forsøket.
  2. Slå på mikroskopet og mikros automatisering og kontroll software. Bruke en høy numerisk apertur (NA) oljeneddyppingsobjektivet for optimal signal innsamling og romlig oppløsning, slik som en 100X, 1,46 NA olje DIC objektiv. Velg riktige filtre og Dichromatic speil for å skaffe differensial interferens kontrast (DIC) bilder og bilder av gul-fluorescerende og røde fluorescerende protein fusjoner.
  3. Plassere en dråpe nedsenking olje på objektiv og tilsett nedsenking væske til bunnen av bildevinduet på mikrofluid plate for å forbedre celle-fokus under bildeopptak. Nøye montere forseglet microfluidic enhet (trinn 2.5) på scenen av invertert mikroskop. Sikre at platen er trygt plassert i den fasen holderen og flytter ikke i løpet av forsøket.
  4. Ta bildevinduet i microfluidic kultur kammeret i fokus ved hjelp av den innebygde posisjonsmarkører til orientering. Fokusere på den ytterste venstre del av den første strømningskammeret (merket "A") med fellen størrelse 5, som tilsvareren felle høyde på 0,7 mikrometer.
  5. I MicroFluidics programvare, veieceller fra innløpet vel 8 på 4 psi for 15 sek. Sjekk celletettheten i kulturen kammeret ved å bevege trinnet på tvers av bildevinduet. Hvis ingen sporer ble fanget, gjenta cellelastingstrinnet eller alternativt øke lasting trykk og / eller tid til ønsket celletetthet oppnås (1-10 sporer per bildevinduet med 2048 x 2048 piksler). Unngå overbelastning kulturen kammeret.
    Merk: Vi bruker vanligvis felle størrelse 5 for bildebehandling Streptomyces, men vi har også fått gode resultater med felle størrelse 4 og 3. Se leverandørens manual for flere forslag på å optimalisere cellelasteprosessen.
  6. Starte strømn programmet i styreprogramvaren fra trinn 2.5 og tillate den mikrofluid platen for varme-likevekt i 1 time i objektbordet før bildeopptak.
  7. I mikroskop software, sette opp en flerdimensjonal oppkjøpet å ta multiple bilder med flere sceneplassering over tid:
    1. For Autolagring: spesifisere katalog for automatisk lagring av bildefilene.
    2. For Illumination innstillinger, bestemme optimale belysnings innstillinger for hver enkelt konstruksjon på forhånd. For den skisserte eksperiment, kan du bruke følgende eksponeringstider: DIC 150 msek, YFP 250 msek, RFP 100 ms.
    3. For Time-serien: sette opp en tidsserie for å hente bilder på de ønskede tidspunkter i rekkefølge. For bildebehandling livssyklus S. venezuelae, velger en 40 minutters tidsintervall i løpet av en 24 timers periode.
    4. For Stage posisjoner og autofokus: skanne kulturen kammeret ved å flytte scenen og store sceneplassering for hver avbildning posisjon av interesse. Sørg for at de enkelte sceneplassering er plassert tilstrekkelig fra hverandre for å minimere photobleaching og phototoxicity.Typically bruke opp til 12 stillinger. Kjør autofokus rutine for hvert tidspunkt å korrigere for treg fokus drift. Hvis det er tilgjengelig i mikroskop kontroll programvare, Satt autofokus strategi for å "lokal overflaten oppdatering av maskinvare autofokus". Når Z-koordinatene til de valgte sceneplassering er bekreftet, aktivere hardware autofokus.
  8. Start time-lapse eksperiment i mikroskopet kontroll programvare.
  9. Sjekk at alle sceneplassering er fortsatt i fokus på senere poeng. For time-lapse eksperimenter som kjører over flere timer, vi tidvis observere en scene drift selv når du bruker autofokus. Hvis sceneplassering må være refocused, stoppe eksperimentet på et passende tidspunkt, justere fokus og starte eksperimentet innenfor det definerte bildetidsintervallet (trinn 3.7.3). Se trinn 4.3 for hvordan du kan sette sammen tidsserien.
  10. Stopp image oppkjøpet etter 24-30 timer eller når hyfer i regionen av interesse har differensiert i sporene (se DIC bildeserie). Stopp flyt program i programvaren og demontere microfluidic enheten.
  11. Forbered brukt mikrofluid plate for kortsiktig storaseri. Fjern gjenværende MYM-TE og tilbrakte MYM-TE fra vel 1 til 6, tom avfallsbrønn 7 og celle lasting vel 8. Under sterile forhold, re-fill brukt brønner lane "A" og brønner av ubrukte baner ( "B" for å "D") på plate med steril fosfatbufret saltløsning (PBS). Tett plate med Parafilm for å hindre at den tørker ut og oppbevares ved 4 ° C.

4. Generation of Time-lapse filmer med Fiji programvare

Merk: Vi registrerer at ulike kommersielle og gratis programvarepakker er tilgjengelige for å behandle time-lapse mikroskopi bilder inkludert ZenBlue, Metamorph, isete, ImagePro eller ImageJ. Her fokuserer vi på Fiji, som er en åpen kildekode bildebehandlingsprogram basert på ImageJ, og som allerede gir en rekke nyttige forhåndsinstallerte plugins.

  1. Overføre bildedata fra din time-lapse eksperiment til en datamaskin som har Fiji installert.
  2. Start programmet og importere bildefilen ved hjelp av &# 34; Fil> Import> Bio-formater ". Eller rett og slett ved å dra bildefilen til Fiji I" Bio-formater for import ", kryss av" delt kanaler "for å få en egen bildestakk for hver belysning kanal (DIC , RFP, YFP).
  3. Valgfritt: Hvis du vil slå sammen separat tidsserien som følge av et brudd i på bildet oppkjøpet på grunn av omstilling (trinn 3.9), åpne respektive bildestakker og kjør "Image> Stabler> Verktøy> Slå sammen" for hver kanal (DIC, RFP, YFP ).
  4. Vurdere kvaliteten på time-lapse data ved å bla gjennom bilde stabler. Se etter hyfer som bodde i fokus over tid, viser mycelial vekst og til slutt danne sporer (DIC bunke). Undersøk forventet subcellulære lokalisering for DivIVA-mCherry på hyphal tips (RFP stack) og FtsZ-YPet dannende enkle ringer eller flere, stige-lignende strukturer i vegetativ eller sporogenic hyfer (YFP stack), henholdsvis.
  5. Isolere et område av interesse for nedstrøms processing av bildene. Time-lapse mikroskopi gir ofte store filer som kan forsinke behandlingen av Fiji. Det anbefales derfor å identifisere og isolere en region av interesse (ROI) og ta ytterligere bildebehandlingstrinn på denne mindre versjon av bildet stabelen.
    1. Velg "Rectangular Selection" -verktøyet i menyen og tegne en rektangulær ROI i DIC bildestakk på en slik måte at utviklings hyfer er omsluttet av ROI hele bildeserie.
    2. Duplicate ROI-stack med "Ctrl" + "Shift" + "D".
    3. Klikk på navnet linjen i YFP bildestakk og velg "Edit> Valg> Gjenopprett Selection" i menyen for å gjenopprette den tidligere rektangulær markering fra den opprinnelige DIC stable til samme kroppsposisjon i YFP stabelen og duplisere ROI med "Ctrl" + "Shift" + "D".
    4. Gjenta denne prosessen for RFP stabelen.
  6. Justere bildene i tre bilde stabler to fjerne scenen driver i xy-planet over tid. Bla til den siste rammen i stabelen DIC og velg "Plugin> Registrering> StackReg> RigedBody" fra menyen. Gjenta dette trinnet for RFP og YFP bildestakk. Om nødvendig, beskjære ROI ved å gjenta trinn 4.5.1-4.5.3.
  7. Valgfritt: Juster lysstyrke og kontrast manuelt for hvert bilde stabel med "justere lysstyrke og kontrast Tool" ( "Ctrl" + "Shift" + "C") eller velg "Process> Forbedre Contrast" fra menyen og bruke "Normaliser" kommandoen til alle bildene i bunken. Det bør bemerkes at den siste kommandoen vil endre pikselverdier og kan derfor påvirke nedstrømsbildeanalyse.
  8. Valgfritt: Kombiner individuelle stabler (konvertert til RGB-filformat, se 4.11) horisontalt eller vertikalt ved hjelp av plugin "Image> Stabler> Verktøy> Kombiner".
  9. Legg en skala bar ( "Analyze> Verktøy> Scale Bar") og en gang stamper (&# 34; bilde> Stabler> Tid Stamper ").
  10. Lagre endrede bilde stabler som en bildesekvens i "TIFF" format. For å produsere en film, lagre som ".avi". Alternativt eksport bildeserie i QuickTime-format ved hjelp av "Bio-formater> Bio-formater eksportør" plugin og velg ".mov" filtype.
  11. For å få bilder fra enkeltbilder, markerer du rammen av interesse og duplisere bildet "Ctrl" + "Shift" + "D". Endre type resultatbildet til "RGB" eller "8-bit" under "Bilde> type> RGB farge eller 8-bit" og lagre bildet som "Tiff".
    Merk: Fiji tilbyr en rekke ekstra funksjoner for å ytterligere kommentere eller prosess time-lapse-serien. Gå til Fiji online support for detaljert informasjon (http://fiji.sc/Fiji).

Representative Results

Den vellykkede levende celle avbildning av hele S. venezuelae livssyklus gir en sammenhengende tidsserie inkludert de sentrale utviklingsstadier av spiring, vegetativ vekst og sporulering (figur 3, Film 1). Visualisering av progresjon gjennom livsløpet er ytterligere forbedret med den distinkte subcellulære lokalisering av DivIVA-mCherry og FtsZ-YPet. Under spiring og vegetativ vekst, DivIVA-mCherry utelukkende akkumuleres på den økende hyphal tips eller merker nylig forming forgreningspunktene (figur 4A). Disse resultatene er i tråd med tidligere rapportert subcellulære posisjonering av DivIVA 12,26. I motsetning til dette danner FtsZ-YPet enkelt ring-lignende strukturer ved uregelmessige intervaller i den voksende mycelium (figur 4B). Disse strukturene gir stillaset for syntese av ikke-Konstriktiv vegetative tverrvegger, som fører til dannelsen av interconnected hyphal avdelinger 8. Den cellulær differensiering av voksende hyfer inn sporogenic hyfer blir synlig etter forsvinningen av polar DivIVA-mCherry brennpunkter, arrestasjonen av polar vekst og samtidig økning av FtsZ-YPet fluorescens (Figur 4C). I sporedannende hyfer, lokalisering mønster av FtsZ-YPet endres dramatisk; første spiral FtsZ-YPet filamenter tørkes langs hypha og deretter, i en plutselig, nesten synkron hendelse, disse spiralene vokser sammen til en stige av jevnt fordelte FtsZ-YPet ringer. Under forsøksbetingelsene er beskrevet her, disse er jevnt fordelt FtsZ-YPet stiger vedvare i ca 2 timer. Endelig sporulation septa bli synlige på differensial interferens kontrast (DIC) bilder (figur 4D) og til slutt nye sporer frigjøres.

Den påfølgende protokollen beskriver bildebehandling bruker Fiji programvare gir som Tep-for-trinn forklaring på hvordan å lage en film for publisering av den kjøpte time-lapse serie (Movie 1).

Figur 3
Figur 3: Snapshot bilder fra en representant time-lapse fluorescens mikros serie S. venezuelae produsere fluorescensmerkede FtsZ (grønn) og DivIVA (Red) Vist er utvalgte rammer av fusjonerte bilder (topp panel: RFP-YFP-DIC, bunnpanelet: DIC). visualisere Streptomyces livssyklus inkludert spiring, vegetativ vekst og sporulation. Bilder ble tatt fra Movie 1. Tid er i hr: min. Skala barer = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

d / 53863 / 53863fig4.jpg "/>
Figur 4: Representative resultater for en vellykket time-lapse serie av Streptomyces livssyklus (A) Lokalisering av DivIVA-mCherry.. Vist er øyeblikksbilder av to påfølgende tidspunkter fra Movie 1 med sammenslåtte bilder av RFP og DIC-kanaler. DivIVA-mCherry markerer nye hyphal avdelingssider (fylt pil hode) og lokaliserer på hyphal spissen for å lede polar vekst (åpen pil hodet). Scale bar = 10 mm (B) FtsZ-YPet lokalisering under vegetativ vekst (pil hodet). FtsZ-YPet danner enkelt ring-lignende strukturer (øvre panel) som ikke constrict (DIC, nedre panel). (C) FtsZ-YPet (grønn) lokalisering under sporulation septumdannelse. DivIVA-mCherry foci er vist i rødt, med tiden som har gått avbildet nedenfor (t: min). Skala: 5 mikrometer. (D) Tilsvarende DIC bilder av sporulerende hyfer fra (C) som viser skjemaetasjon av prespore lommer med synlig sporulation septa (venstre bilde), som til slutt modnes inn i en kjede av sporer (høyre bilde). Tiden er i hr: min. Scale bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bilde fra filmen 1
Film 1: Time-lapse fluorescens mikros serie av Streptomyces venezuelae livssyklus Filmen består av flettede RFP-YFP bilder (til venstre) og de ​​tilhørende differensial interferens kontrast (DIC) bilder (til høyre).. DivIVA-mCherry vises i rødt og FtsZ-YPet i grønt. Tidsintervallet mellom enkeltbilder er 40 min. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se this film.

Discussion

Time-lapse mikroskopi av Streptomyces livssyklus har vært teknisk utfordrende i det siste. Her presenterer vi en robust protokoll for å opptre live-cell imaging av hele livssyklusen ved hjelp av fluorescerende protein fusjoner til cellen polaritet markør DivIVA og celledeling protein FtsZ å visualisere og spore progresjon gjennom utviklingsprogram (figur 2).

Sentralt i denne metoden er dyrking av S. venezuelae i en microfluidic enhet som gjør konstant medium perfusjon og utveksling av normal vekst medium (MYM-TE) med brukt medium (brukt MYM-TE). Endringen av kultur tilstand er viktig for den beskrevne protokollen fordi den ernæringsmessige nedgiring som brønner som noen ennå uidentifiserte ekstracellulære signaler (f.eks quorum sensing signaler) i det brukte kulturmediet, fremme sporulation, mens en kontinuerlig tilførsel av næringsrikt medium stimulerer vegetativ growtt med nesten ingen sporedannelse (data ikke vist). Således dyrking av cellene i denne mikrofluidsystem er overlegen i forhold til dyrkning av celler i agarose, fordi det gir mer fleksibilitet eksperimentelt og tillater langtidsovervåking av endringer i bakterievekst i respons til endring av dyrkningsforhold. Selv om microfluidic platene er konstruert for engangsbruk, strømningskanaler som ikke er blitt inokulert med celler som kan anvendes i de etterfølgende eksperimenter. Vi anbefaler å bruke alle kanaler for en microfluidic plate innen en uke, som vi har opplevd problemer tetting manifolden til plater som er åpnet for lengre tid.

Når du setter opp et eksperiment, fant vi at nylagede sporer spirer innen to timer for å bli lastet inn i flyten kammeret, mens sporer stammer fra en frossen glyserol lager kreves minst seks timer før bakterie rør dukket opp (data ikke vist). Denne forsinkelsen i spiring strekker seg over lengden av eksperimentet, og kan forstyrreutstyr tilgjengelighet og eksperimentelle forhold. Det er også viktig å starte forsøket med perfusjon av MYM-TE i minst 3 timer for å gi tilstrekkelig næringsstoffer for utvikling og utvekst av bakterie rør. Perfusjon med MYM-TE kan utvides utover den opprinnelige 3 timer dersom forsøket er utformet for å studere vegetative vekst. Mens sporer tilveiebringe det foretrukne valg av utgangsmateriale, kan kort hyphal fragmenter også bli lastet inn i mikrofluid plate. Men lasteeffektivitet ved bruk skåret mycel er betydelig lavere og ofte krever flere laste løper som kan utgjøre en begrensning når undersøke ikke-sporedannende mutanter. Uavhengig av den type som ble anvendt, er det viktig ikke å overbelaste kulturen kammer med sporer eller hyphal fragmenter, da dette vil føre til rask overbefolkning som kan forstyrre mediene diffusjon og komplisere bildeanalyse.

Det er viktig å planlegge byggingen av reporter proteiner carefully for bruk i fluorescens time-lapse bildebehandling i Streptomyces. Linkerlengde mellom målproteinet og det fluorescerende reporter og valg av N- eller C-terminale fusjoner kan være kritisk. Videre optimale forsøksbetingelser, herunder bildefrekvens og eksponeringstid, må bestemmes på forhånd for hvert fluorescent-merket protein. S. venezuelae hyfer oppviser auto-fluorescens i det grønn / gul kanal som kan bli problematisk når avbildning av et fluorescensmerket protein som blir uttrykt på lave nivåer. I tillegg bør det bemerkes at, under spiring og den første vegetative vekstfase, S. venezuelae er spesielt følsomme for kortbølget lys (for eksempel når du bruker proteinfusjoner til CFP).

Til tross for de kontinuerlige fremskritt i bildeteknikker og fluorescerende reporter systemer for live-cell imaging av bakterier, de fleste av programvarepakker (f.eks MicrobeTracker, Schnitzelcalen, CellProfiler) for den etterfølgende automatisk behandling av slike datasettene støtter ikke analysen av bilder avledet fra trådformede bakterier med et flercellet livsstil 27-29. Det er således et behov for å utvikle en egnet algoritme for kvantitativ high-throughput-analyse av bildedata fra Streptomyces og andre trådformede bakterier.

Oppsummert er arbeidet som er beskrevet her demonstrerer det enorme potensialet av S. venezuelae som en ny modell utviklingssystem for slekten, på grunn av dens evne til å sporulere i væske. Den microfluidic dyrking enheten er enkel å bruke selv for uerfarne brukere. Det gir en utmerket plattform for å studere cellebiologiske prosesser som er sentrale for Streptomyces livssyklus, inkludert dynamisk protein lokalisering, polarisert vekst, og den morfologiske differensiering av en flercellet mycel i varetekt i unigenomic sporer. I tillegg denne eksperimentelle satt up bringer også en fristende utgangspunkt for å undersøke hendelser i utviklingen som krever vekslende dyrkingsbetingelser, eller bruken av fluorescerende fargestoffer som for eksempel fluoriserende D-aminosyrer for å overvåke peptidoglykansyntesen eller propidiumjodid og 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for å visualisere kromosom organisasjon 30,31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells Merck-Millipore B04A-03-5PK Microfluidic culture plates
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) Merck-Millipore EV-262 The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss 431007-9902-000 Fully automated and motorized inverted widefield microscope
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 Zeiss 411857-9061-000 Environmental chamber surrounding the microscope
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective Zeiss 420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2 Hamamatsu Photonics K.K. C11440-22CU
Illuminator HXP 120V Zeiss 423013-9010-000
FL Filter Set 46 HE YFP shift free Zeiss 489046-9901-000 Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm
FL Filter Set 63 HE RFP shift free Zeiss 489063-0000-000 Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm
Mounting frame K-M for multiwell plates Zeiss 000000-1272-644 Stage holder for microfluidic plate
ZEN pro 2012 Zeiss 410135-1002-120 Microscope control software
ZEN Module Time Lapse Zeiss 410136-1031-110 Software module to set up time-lapse microscopy experiments
ZEN Module Tiles/Positions Zeiss 410136-1025-110 Software module to save specific stage positions (xzy)
Fiji open-source software package http://fiji.sc/Fiji Generation of time-lapse movies
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)
4 g Maltose
4 g Yeast extract
10 g Malt extract
add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving		 Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60
R2 Trace element solution (TE)
8 mg ZnCl2
40 mg FeCl3-6H2O
2 mg CuCl2-2H2O
2 mg MnCl2-4H2O
2 mg Na2B4O7-10H2O
2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O
add 200 ml H2O
Autoclave and store at 4 oC		 Add 0.002 volumes to MYM
PBS (phosphate buffered saline) Sigma P4417-100TAB Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.
0.22 µm syringe filters Satorius stedim 16532-K Preparation of spent MYM-TE
SV60 John Innes Centre strain collection S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes. Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).
  2. Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere? Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).
  3. McCormick, J. R., Flärdh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).
  4. Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces. Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).
  5. Hempel, A. M., et al. The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).
  6. Fuchino, K., et al. Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).
  7. Holmes, N. A., et al. Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).
  8. McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).
  9. Margolin, W. FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).
  10. Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).
  11. Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria. PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).
  12. Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).
  13. Wolanski, M., et al. Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).
  14. Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).
  15. Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces. Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).
  16. Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures. J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).
  17. Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN. Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).
  18. Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development. PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).
  19. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. MBio. 4, e00684-e00613 (2013).
  20. Tschowri, N., et al. Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development. Cell. 158, 1136-1147 (2014).
  21. Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis. PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).
  22. Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (e50456), (2013).
  23. Meniche, X., et al. Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).
  24. Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum. PLoS One. 8, e55078 (2013).
  25. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).
  26. Flärdh, K. Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).
  27. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).
  28. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).
  29. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
  30. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).
  31. Szafran, M., et al. Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation. J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).

Tags

Immunologi , Time-lapse mikroskopi FtsZ DivIVA polar vekst sporulation utvikling microfluidic enhet Fiji programvare.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

The author's name was updated from:

Mark Buttner

to:

Mark J. Buttner

Fluorescens Time-lapse Imaging av Complete<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Life Cycle Ved hjelp av en mikrofluid Device
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schlimpert, S., Flärdh, K.,… More

Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (108), e53863, doi:10.3791/53863 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter