La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em> En Ovo</em> Micro-electroporación
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
Embriones de pollo son sistemas modelo ideal para estudiar el desarrollo embrionario como manipulaciones de la función de genes pueden llevarse a cabo con relativa facilidad in ovo. El órgano sensorial auditivo del oído interno es fundamental para nuestra capacidad de oír. Alberga un epitelio sensorial altamente especializado que consiste en células ciliadas mecano-transducción (HC) y que rodea la glía como células de soporte (SCS). A pesar de las diferencias estructurales en los órganos auditivos, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo del órgano auditivo se conservan evolutivamente entre los mamíferos y aves En electroporación in ovo está muy limitado a las primeras etapas de E1 -. E3. Debido al desarrollo relativamente tarde del órgano auditivo en E5, manipulaciones del órgano de la audición por electroporación in ovo en el pasado E3 son difíciles debido al avanzado desarrollo del embrión de pollo en etapas posteriores. El método que aquí se presenta es un método de transferencia génica transitoria para dirigir genes de interés enetapa E4 – E4.5 en el auditorio de pollo en desarrollo a través de los órganos sensoriales in ovo micro-electroporación. Este método es aplicable para ganancia y la pérdida de funciones con vectores de expresión basados en el ADN de plásmido convencional y se puede combinar con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU (5-etinil-2 'desoxiuridina) a todo el embrión en el tiempo de electroporación. El uso de la proteína fluorescente verde o roja (GFP o RFP) plásmidos de expresión permite al experimentador para determinar rápidamente si la electroporación dirigido con éxito la porción auditiva del oído interno en desarrollo. En este trabajo el método, se ilustran ejemplos representativos de las muestras GFP a electroporación; embriones se recogieron 18 a 96 h después de la electroporación y la selección de GFP a la zona de pro-sensorial del órgano auditivo se confirmó mediante hibridación in situ de ARN. El papel método también proporciona un protocolo optimizado para el uso de la timidina analógico EdU para analizar prolife célularación; Se proporciona un ejemplo de un ensayo de proliferación celular basado EdU que combina inmuno-etiquetado y haga clic en la química edu.
Introduction
A pesar de las diferencias en la morfología celular y patrones entre los mamíferos y órgano sensorial auditivo aviar, se cree que están conservadas evolutivamente 1-3 los factores moleculares y las vías responsables del desarrollo de HC sensorial. La papila basilar, que aloja la HC auditivas y sus alrededores SC, se desarrolla como la protrusión de la otocyst oído interno. Al principio de un grupo de progenitores de HC y SC se especifica dentro de la placoda ótica / Dominio competente taza neuronal sensorial-ótica (NSD). Los datos de mapeado de destino proporcionan evidencia de que los linajes neuronales y sensoriales están vinculados y se derivan de la NSD situado en la región antero-ventral de la copa ótica o otocyst en ratones y pollos 4,5. En primer lugar, los neuroblastos delaminate de la NSD para dar lugar a las neuronas del ganglio auditivo-vestibular, que finalmente dividido en ganglios auditivo y vestibular. Estas neuronas inervan los HC sensoriales del oído interno y núcleos en el tronco cerebral. Las células Tha permanecer en el NSD se cree que dar lugar a varios parches sensoriales, incluido el órgano sensorial auditivo, que consta de los HC sensoriales mecano-transducción y sus asociados SCs.
En tanto el pollo y murino, órgano de la audición sensorial progenitora salida del ciclo celular y la diferenciación HC se producen en gradientes opuestos. En polluelo, la salida del ciclo celular progenitora auditiva comienza alrededor de ~ E5 y progresa desde la base hasta el vértice, y desde el centro hacia la periferia 6. Un día después, HC diferenciación comienza en el vértice y que avanza a la base 7. Estudiar el desarrollo del oído interno en el pollo proporciona muchas ventajas técnicas como mecanismos funcionales pueden ser investigados con relativa facilidad in ovo en comparación con la manipulación de los embriones en el útero en otros sistemas modelo, que requiere cirugías complejas. El método descrito aquí utiliza in ovo micro-electroporación para apuntar genes de interés en el Basila presuntivar área de la papila antero-ventral en la vesícula ótica específicamente a E4.
La electroporación in ovo es una técnica que está bien establecido y comúnmente utilizado 8-14. El principio de la técnica de electroporación se basa en el hecho de que los nucleótidos (por ejemplo, ADN plásmido, ADN sintético, o ARN oligonucleótidos) están cargadas negativamente. El ADN se inyecta en el tejido de interés. Cuando una corriente eléctrica se coloca a través del tejido, la corriente abre los poros transitorios en las paredes celulares y permite la captación del ADN, como fluye el ADN cargado negativamente hacia el electrodo positivo (ánodo). Para los experimentos de ganancia de función, los genes de interés se subclonan comúnmente en plásmidos de expresión que contienen casetes de expresión adecuados para la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína fluorescente roja (RFP). Para los experimentos de construcciones de pérdida de función basados en plásmidos dominantes negativos represores, o RNAi, o construcciones de morfolino son commonly utiliza 15,16. Para inhibir microARN (miARN) de función miRNAs construcciones de esponja, que son típicamente plásmido basado, se puede utilizar 17. El método aquí descrito permite la investigación de los mecanismos moleculares que controlan la proliferación y diferenciación en el órgano auditivo, como el método en micro-electroporación in ovo se puede combinar fácilmente con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU a todo el embrión.
La electroporación y la adición de EdU se realiza a E4 en la vesícula ótica, que es un día antes del inicio de la salida del ciclo celular en el órgano auditivo. Análisis del órgano de la audición se realiza típicamente 18 de – 96 horas después de la electroporación en E5 (inicio de la salida del ciclo celular progenitora sensorial), E6 (inicio de la diferenciación HC), y E7 (durante la diferenciación HC); y más tarde hasta ~ E9 (final de la diferenciación HC). Este método de electroporación de la transferencia genética es transitoria que dura aproximadamente ~ 4 días, because los genes de interés no se integran en el genoma, pero el método es aplicable para su uso con vectores de expresión basados en el ADN de plásmido apropiado, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma, tales como la transferencia de genes mediada por Tol2 11. Con este método robusto GFP o RFP expresión dura ~ 4 días en la cóclea, después de lo cual las señales se desvanecen, sin embargo, proporcionan una ventana de tiempo suficiente para estudiar la intrincada desarrollo del órgano auditivo. Esto, a su método de transferencia génica in ovo es novedosa y permite apuntar específicamente el órgano auditivo presuntiva en E4, que es óptima para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Es una buena adición a procedimientos alternativos, que electroporate en etapas de desarrollo mucho más jóvenes o 11,12 en comparación con el uso de cultivos de explantes in vitro papilas basilar 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método aquí descrito de in ovo micro-electroporación se ha optimizado para la transferencia de genes en el órgano auditivo en desarrollo. Es compatible con vectores de expresión basados en el ADN de plásmido normalmente se utilizan para manipular la función del gen / expresión. El momento de la electroporación a E4 es óptimo para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Los pasos más críticos son micro-inyección de la DNA en el lumen vesícula ótic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Doris K. Wu de plásmidos de expresión y sondas in situ, el Centro de la Universidad Johns Hopkins para la instalación de imágenes Biología Sensorial y el Centro para la audición y el equilibrio. Este trabajo fue apoyado por NIDCD subvención T32 DC000023 de LE
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
Riferimenti
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