エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少
Summary
A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.
Abstract
配列決定されたゲノムと豊富な表現型可塑性とエンドウAcyrthosiphonエンドウアブラムシは、ゲノムおよび発達の研究のための新たなモデルとなっています。他のアブラムシ、Aのよう 。 エンドウ胚は卵巣管に組立ライン方式で卵の室内で開発単為生殖胎生再現、を経て急速に伝播します。これまで我々は、アブラムシの胚におけるmRNA発現の検出を可能にするin situハイブリダイゼーションホールマウントの堅牢なプラットフォームを確立しています。タンパク質の発現を分析するために、しかし、満足な結果を生じなかった無性胎生アブラムシのovariolesを免疫染色するためのプロトコルを確立しました。ここでは、組織透過性を増加させ、確立されたアプローチを適用する際に問題があったどちらもバックグラウンド染色を、減少させるための最適化された条件をレポートします。最適化が含まれます：必須のFを発見されたプロテイナーゼK（1 / mlの、10分）、の（1）のインキュベーション中・後期アブラムシ胚または抗体の浸透; （2）ジゴキシゲニン（DIG）により供給されるブロッキング試薬と正常ヤギ血清/ウシ血清アルブミンの交換は、バッファセットと、内因性ペルオキシダーゼを漂白するためにメタノールではなく、過酸化水素（H 2 O 2）、（3）アプリケーションをベース。これはかなりアブラムシ組織におけるバックグラウンド染色を減少させました。免疫染色のために最適化されたこれらの重要な条件は、A。 エンドウ及び他のアブラムシの胚における遺伝子産物の効果的な検出を可能にします。
Introduction
アブラムシは、小さな（1-10 mm）のソフトボディと半翅目の昆虫です。彼らはピアス口器と師部の樹液を吸引することにより、植物を餌に。さらに、彼らは師部樹液の食事で不足している必須アミノ酸を合成するために、必須の細胞内共生細菌、 ブフネラの aphidicolaに依存しています。アブラムシは、春と夏の長日日長、彼らは越冬卵1,2の数が限られて横たわっている間、短日の光周期によってトリガ性的卵生再生時の単為生殖胎生再生を含んで複雑 な生活史を持っています。春に秋まで単為生殖の多くのラウンドに続いて、すべての女性のアブラムシ（fundatrices）の第一世代を生成するために、これらの卵が孵化。毎年恒例のライフサイクルにおける無性生殖と有性段階の代替アブラムシの周期的単為生殖は、進化のノベルティ1,2と見なされてきました。単為生殖胎生アブラムシで、胚発生は、卵巣細管（ovarioles）の卵の室内で行われます。これとは対照的に、性的卵生の胚は受精卵で開発しています。別に生殖可塑性から、アブラムシは、世代間の翼polyphenismを表示することができます。過密信号と捕食者の脅威に対応して、翼のない無性女性はviviparously長距離移動のための翼の子孫を生成することができます。エンドウヒゲナガアブラムシのゲノム配列の公表Acyrthosiphonエンドウ -theの最初のゲノム配列基礎不完全変態の昆虫ができます生殖可塑性、翼polyphenism、分子のアブラムシで昆虫植物の相互作用、ウイルスベクタとの共生など、他の機能のさらなる調査基礎3。
ゲノム配列決定に加えて、遺伝子発現および機能を特徴づけるためのツールは、成熟したモデル生物として4エンドウアブラムシを促進するために必要とされます。我々は全体のマウントの堅牢なプロトコルを記載しています<em>アブラムシ胚5-7でのmRNAの発現を検出するためのin situハイブリダイゼーション。二本鎖RNAの注入と給電ビアRNA干渉（RNAi）はアブラムシの幼虫及び成虫における遺伝子サイレンシングのために使用されてきたが、胚における遺伝子ノックダウンのための安定した条件がまだ8-10報告されていません。免疫染色、およびRNAiノックダウン後、エンドウアブラムシ胚11-13で行われた前のサンプル中のタンパク質の発現を検出することができる抗体に基づくアプローチ。しかし、組織透過性およびバックグラウンド染色の除去の増加は、エンドウアブラムシの無性胎生胚における免疫染色のための標準プロトコルを使用して、まだ不十分です。たとえば、私たちは、組織への抗体の浸透が（ステージ8-10）胚をgastrulatingに減少し、形態学的に識別可能な肢芽（ステージ13〜14）との胚は、抗体にほとんど透過性であることがわかりました。また、バックグラウンド染色は無性viviparoで可視化されました私たちエンドウアブラムシの胚は、生殖細胞系列マーカーヴァーサだけでなく、胚性セグメント12,13で表現エングレイルド/半円形の波形のタンパク質に対するそのに対する抗体を用いて染色しました。実際にはバックグラウンド染色は、まだ二次抗体のみで染色した胚ではっきりと見えました。
アブラムシ組織の完全性に損傷を与えることなく、透過性を高めるために、我々は慎重にプロテイナーゼKの濃度を滴定し、アブラムシの胚における組織消化のための最適条件を決定しました。エンドウアブラムシに非特異的な染色を避けるために、我々は、効率的に胚をブロックし、免疫染色の間、信号を増幅するために用いられる酵素の内因性のペルオキシダーゼ（POD）の活性を抑制し得る化合物について検索しました。伝統的に使用される通常のヤギ血清ではなく（NGS）、ジゴキシゲニン（DIG）ベースのバッファセットによって提供されるブロッキング試薬/ウシ血清アルブミン（BSA）は、有意にバックグラウンド染色を減少させました。また、メタノールはINHIことが見出されましたより効果的に過酸化水素（H 2 O 2）に比べ、内因性POD活性をビット。胚の免疫染色のためにこれらのアブラムシ、特定の条件に関する詳細は、以下のセクションで説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、エンドウヒゲナガアブラムシAの成功免疫染色するために重要最適な条件を特定した。 エンドウ 、ゲノムおよび発達研究3,15のための新たなモデル生物。組織透過性を増加させ、バックグラウンド染色を低減するための最適化された条件は、信号の強度および特異性を増強しました。それらは、細胞膜の孔を作成して、非特異的抗体結合をブロックするための?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).
Materials
| 30% hydrogen perxidase (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 1.1586E+10 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
Riferimenti
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