Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

Summary

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Abstract

El Acyrthosiphon pisum pulgón del guisante, con un genoma secuenciado y abundante plasticidad fenotípica, se ha convertido en un modelo emergente para estudios genómicos y de desarrollo. Al igual que otros pulgones, A. Pisum propaga rápidamente a través de la reproducción vivípara partenogenética, donde los embriones se desarrollan dentro de las cámaras de huevo en forma de línea de montaje en el ovariole. Anteriormente hemos establecido una plataforma robusta de todo el montaje hibridación in situ que permite la detección de la expresión de mRNA en los embriones de áfidos. Para el análisis de la expresión de la proteína, sin embargo, establecido protocolos para inmunotinción los ovarioles de áfidos vivíparos asexuales no produjo resultados satisfactorios. Aquí mostramos condiciones optimizadas para aumentar la permeabilidad de los tejidos y la disminución de la tinción de fondo, los cuales eran los problemas en la aplicación de enfoques establecidos. Optimizaciones incluyen: (1) incubación de proteinasa K (1 mg / ml, 10 min), que se encontró f esencialo la penetración de anticuerpos en embriones de mediados y finales de etapa de áfidos; (2) la sustitución de albúmina de suero de suero de cabra / bovino normal con un reactivo de bloqueo suministrada por un digoxigenina (DIG) a base de juego de tampones y (3) la aplicación de metanol en lugar de peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂₎ para el blanqueo de la peroxidasa endógena; que redujo significativamente la tinción de fondo en los tejidos de áfidos. Estas condiciones críticas optimizados para inmunotinción permitirá la detección eficaz de los productos de los genes en los embriones de A. Pisum y otros pulgones.

Introduction

Los áfidos son insectos hemípteros con pequeñas (1.10 mm) cuerpos blandos. Se alimentan de las plantas al chupar la savia del floema con piezas bucales penetrantes. Además, se basan en una bacteria endosimbiótica obligado, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos esenciales que son deficientes en la dieta savia del floema. Los áfidos tienen una historia de vida complejo que incluye la reproducción vivípara partenogenética durante la primavera y el fotoperíodo largo día de verano y la reproducción ovípara sexual provocada por fotoperiodos de día corto durante el cual se ponen un número limitado de huevos invernantes ^1,2. En la primavera de estos huevos eclosionan para producir la primera generación de la todo-hembra áfidos (fundatrices), después de muchas rondas de reproducción partenogenética hasta el otoño. La partenogénesis cíclica de áfidos, donde las fases asexuales y sexuales se alternan en el ciclo de vida anual, ha sido considerado como un ^1,2 novedad evolutiva. En los áfidos vivíparos partenogenéticos, La embriogénesis se lleva a cabo dentro de las cámaras de huevo de los túbulos de ovario (ovarioles). Por el contrario, los embriones ovíparos sexuales se desarrollan en los huevos fertilizados. Aparte de la plasticidad reproductiva, los áfidos pueden mostrar polyphenism ala transgeneracional: en respuesta a señales de hacinamiento y las amenazas de depredadores, las hembras sin alas asexuales pueden producir vivíparas descendiente alado para la migración de larga distancia. La publicación de la secuencia del genoma del pulgón del guisante Acyrthosiphon pisum -la primera secuencia del genoma de un basal insectos permite hemimetabolous mayor exploración de la plasticidad reproductiva, ala polyphenism, y otras características que incluyen interacciones insecto-planta, vectorización viral y la simbiosis de áfidos en una molecular base ^3.

Además de la secuencia del genoma, se requieren herramientas para la caracterización de la expresión génica y la función de promover el pulgón del guisante como un organismo modelo madura ^4. Hemos descrito los protocolos robustos de todo el montaje <em> hibridación in situ para detectar la expresión de mRNA en embriones de áfidos ^5-7. ARN de interferencia (RNAi) a través de la inyección de ARN de doble cadena y la alimentación se ha utilizado para el silenciamiento de genes en ninfas de áfidos y adultos, pero las condiciones estables para el gen desmontables en los embriones aún no se ha informado de ^8-10. La inmunotinción, un enfoque basado en anticuerpos que puede detectar la expresión de proteínas en las muestras antes y después de RNAi desmontables, se ha realizado en embriones pulgón del guisante ^11-13. Sin embargo, el aumento de la permeabilidad de los tejidos y la eliminación de la tinción de fondo es aún insatisfactoria utilizando protocolos estándar para la inmunotinción en los embriones vivíparos asexuales del pulgón del guisante. Por ejemplo, hemos encontrado que la penetración de los anticuerpos a los tejidos disminuyó en embriones gastrulating (etapas 8-10) y que los embriones con yemas de las extremidades morfológicamente identificables (etapas 13-14) eran apenas permeable al anticuerpo. Además, la tinción de fondo se visualizó en el vivíparo asexualnosotros los embriones pulgón del guisante teñidas utilizando el anticuerpo contra el marcador de la línea germinal Vasa, así como que contra la proteína Engrailed / Invected expresado en los segmentos embrionarias ^12,13. En realidad la tinción de fondo seguía siendo claramente visible en los embriones teñidos con el anticuerpo secundario solo.

Con el fin de aumentar la permeabilidad sin dañar la integridad de los tejidos de áfidos, que valora cuidadosamente la concentración de proteinasa K y se determinó las condiciones óptimas para la digestión del tejido con embriones de áfidos. Con el fin de evitar la tinción no específica en el pulgón del guisante, se realizaron búsquedas de compuestos que podrían bloquear con eficacia los embriones y reprimir la actividad de la peroxidasa endógena (POD), una enzima utilizada para amplificar señales durante inmunotinción. Un reactivo de bloqueo proporcionada por un digoxigenina (DIG) juego de tampones con base, en lugar del suero normal de cabra utilizado tradicionalmente (NGS) / albúmina de suero bovino (BSA), redujo significativamente la tinción de fondo. Por otra parte, el metanol se encontró que INHImordió la actividad POD endógena de manera más eficaz que el peróxido de hidrógeno (H _{2 O 2).} Los detalles relativos a estas condiciones de áfidos específica para la inmunotinción con embriones se describen en las siguientes secciones.

Protocol

1. Cultura de áfidos NOTA:. La cepa de laboratorio de la partenogenética vivíparos pulgón del guisante Un pisum se recogió originalmente en el centro de Taiwan, y se ha criado en las plantas hospedantes (la sativum jardín guisante Pisum o haba Vicia faba) bajo largo día fotoperiodo para más de 300 generaciones (una generación: ~ 10 días). La germinación de las semillas Remoje las semillas de plantas hospederas en agua del grifo durante 3…

Representative Results

En este estudio, hemos realizado todo el montaje-inmunotinción con embriones de áfidos del guisante asexuales (Figura 1A). Estas hembras producen crías partenogenéticamente y vivíparas. Estos embriones femeninos se desarrollan dentro de las cámaras de huevo de los túbulos de ovario (ovarioles) (Figura 1B y la Figura 2A). Antes de la microscopía, las ovarioles disecados son los objetivos de tinción; sin embargo, …

Discussion

Identificamos óptimas condiciones críticas para la inmunotinción éxito en el pulgón del guisante A. Pisum, un organismo modelo emergente para estudios genómicos y de desarrollo ^3,15. Condiciones optimizadas para aumentar la permeabilidad del tejido y la reducción de la tinción de fondo mejorado la intensidad y especificidad de las señales. Se diferencian de los protocolos estándar para la inmunotinción en otros modelos animales en los pasos para la creación de poros en las membra…

Materials

30% hydrogen perxidase (H₂O₂)	Sigma-Aldrich	18304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody	Developmental studies hybridoma bank	AB_528224	For labeling the developing segments of embryo.
ApVas1 rabbit polyclonal antibody	Our laboratory	N/A	For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory.
Austerlitz Insect pins	ENTOMORAVIA	N/A	For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Camera connted to compound microscope	Canon	EOS 5D	For photographing of aphid embryos.
Colorimetric 8 cell tray	Kartell Labware	357	For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm.
Compound microscope with DIC optics	Leica Microsystems	DMR	For photographing of aphid embryo mounted on the slides.
DIG Wash and Block Buffer Set	Sigma-Aldrich (Roche)	1.1586E+10	For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent.
Forceps	Ideal-tek	N/A	For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA.
Glass dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	For clearing of aphid embryos and mounting.
Glycine	Bioshop	N/A	For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK).
Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11017	For detection of primary antibody from mouse.
Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633	Invitrogen	A21072	For detection of primary antibody from rabbit.
Intelli mixer	ELMI laboratory equipment	RM-2M	For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries.
Laser-scanning confocal microscopy	Leica Microsystems	SP5	For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag.
methanol	Burdick and Jackson	AH2304	For bleaching endogenous peroxidase of embryos.
Microscope slides	Thermo scientific	10143560	For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm.
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101030	For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
Microscope Cover glasses	Marienfeld	0101050	For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A)	Santa Cruz Biotechnology	sc-32293	For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells.
Nail polish	N/A	N/A	For sealing the coverslips on the slides.
Normal goat serum (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	For blocking the non-specific binding of antibodies.
Paraformaldehyde (PFA)	VWR	MK262159	For fixation of aphid ovaries.
Phalloidin-TRITC	Sigma-Aldrich	P1951	For labeling the distrbution of F-actin on embryos.
Phosphate-buffered saline (PBS)	N/A	N/A	As isotonic solution for aphid ovaries.
Plastic dropper	N/A	N/A	For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml.
Proteinase K	Merck	124678	For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies.
Pyrex spot plate	N/A	N/A	For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and  depth 7 mm.
SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets	Sigma-Aldrich	D4168	For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set.
Stereo microscope	Leica Microsystems	EZ4	For dissection and observation of aphid ovaries.
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787	For creating pores (punching) on the cell membrane.
VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)	Vector laboratories	PK-6101	For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents.
VECTASHIELD mounting medium	Vector laboratories	H1000	For clearing of aphid embryos and mounting.