Användningen av reporter möss kopplade till hela berget och avsnitt färgning, mikroskopi och in vivo underlättar analys av mekanismerna bakom den normala mönstring av luftvägarna. Här beskriver vi hur dessa tekniker har bidragit till analysen av Wnt-signalering under trakeal utveckling.
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Luftvägarna utveckling initieras av embryonala dag 9 (E9) med utseendet på Nkx2.1 positiva celler i den ventrala endodermalt foregut 1,2. Esofagus-trakealtub separation kommer att lösa genom E11.5 när rören kan urskiljas som separata enheter, alla omgivna av mesenkymala vävnaden tre. Wnt-signalering spelar en nyckelroll i specificeringen av luftvägarna som radering av Wnt2 och Wnt2b, uttrycks genom splanchnicus mesenkym och radering av β-catenin från endodermalt respiratoriska epitelet resulterar i lung agenesi 4,5. Våra tidigare studier fastställt att strykningen av WLS, en last receptor som medierar sekretion av alla Wnt-ligander, från endodermala andningsvägarna leder till lung hypoplasi, defekter i pulmonell vaskulär utveckling och mis-mönstring av luftrör mesenkym 6,7. Dessa data stöder betydelsen av epitel-mesenkymala cross prata i celldifferentiering och specifikation, eftersom det har också visats i andra studier 8,9.
Studien av de tidigaste stadierna av lungutveckling bygger på genetisk in vitro och ex vivo-tekniker som har gjort det möjligt för oss att bättre förstå mekanismer som driver andnings identitet 10-16. Hela lung Explantation kulturer vid luftvätskeinter har i stor utsträckning använts för att studera effekterna av tillväxtfaktorer i tidiga skeden av lung förgrening morfogenes 10,17,18. Även om denna metod används som avläsning av morfologiska förändringar, såsom förgrening morfogenes och genuttryck modulering, är den begränsad till studiet av tidiga stadier av utvecklingsprocessen, eftersom kulturen själv inte stödja utvecklingen av kärlsystemet 17. Utveckling av luftrör brosk kräver längre inkubationstider som kan vara inte är kompatibla med denna odlingsteknik.
att analyze roll Wnt-signalering under luftvägarna bildningen, har vi anpassat standardtekniker för att möta behoven hos våra embryonala studier. Vi har ändrat volymer, färgningstider, bearbetning cykling för paraffininbäddning och tidpunkten för clearing av luftrör-lungvävnad. Huvudsyftet med att optimera de metoder som beskrivs i denna studie var att analysera de tidigaste stadierna av trakeal utveckling hos möss som sker från E11 till E14.5. Använda reporter möss linje Axin2LacZ vi exakt bestämda platser i Wnt / β-catenin aktivitet i utvecklings luftrör mesenkym. Vi har också anpassat lektin färgningsprocedur för hela berget trakeal vävnad. Därför kunde vi visualisera mesenkymala förtätningar och förutsäga platser där kondrogenes kommer att äga rum. Färgning av hela berget och delar av embryonal vävnad som erhållits från WlsShhCre möss, tillsammans med avancerad mikroskopi tekniker tillät oss att avslöja den roll som Wnt-ligander som produceras av traCHEAL epitel i luftstrupen mönstring.
Händelser ligger till grund för morfogenes av luftvägarna är inte klarlagd, speciellt de processer som krävs för mönstring av de ledande luftvägarna. Tidigare studier har använt ex vivo-tekniker, där utvecklings explantat odlas vid luft-vätskeinter eller inbäddade i matrigel 21,22. Dessa studier har visat hur tillväxtfaktorer påverkar mönstringen av framkallnings trakea och bildandet av trakeal brosk. En begränsning till dessa studier är att arkitekturen i vävnaden inte är väl und…
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner hjälp av Mike Muntifering och Matt Kofron med konfokal avbildning och Gail Macke med histologiska förfaranden. Detta arbete har delvis stöd av National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 till DS).
Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
NP4O | Life Technologies | 85124 | |
Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
PFA (16%) | EMS | 15710 | |
PBS | Gibco | 70011-044 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
BrDu | Sigma | B5002-5g | |
Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
Permount | Fisher | SP15-500 | |
Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Micro knives | FST | 10318-14 | |
Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
Microtome | Leica | RM2135 | |
Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |