La generazione di cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti in vitro consente l'accesso a grandi quantità di tessuto cardiaco in vitro per la scienza di base e le applicazioni cliniche. Questo protocollo utilizza il fattore atrializzante Grem2 sia per aumentare il numero di cardiomiociti ottenuti sia per generare cardiomiociti con un fenotipo atriale.
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Articolo metodologico
Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2
In questo articolo
Sommario
Abstract
Protocolli per la generazione di popolazioni di cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti sono state sviluppate, ma questi in genere produrre cellule di fenotipi misti. I ricercatori interessati a perseguire studi condotti su specifici sottotipi miociti richiedono un approccio più diretto differenziazione. Trattando staminali embrionali (ES) cellule di topo con Grem2, un antagonista BMP secreta che è necessario per la formazione camera atriale in vivo, un gran numero di cellule cardiache con un fenotipo atriale può essere generato. L'utilizzo della linea di cellule staminali pluripotenti Myh6-DsRed-Nuc ingegnerizzato permette l'identificazione, la selezione e la purificazione dei cardiomiociti. In questo protocollo corpi embrionali sono generati dalle cellule Myh6-DsRed-Nuc utilizzando il metodo goccia e mantenute in sospensione fino differenziazione giorno 4 (D4). A cellule d4 sono trattati con Grem2 e placcato su piastre rivestite di gelatina. Tra D8-D10 grandi aree contraenti si osservano nelle culture e continuano ad espandersi e mtura attraverso d14. Molecolare, analisi istologiche e electrophysiogical indicano le cellule in cellule Grem2-trattati acquisiscono caratteristiche atriale-like che forniscono un modello in vitro per studiare la biologia dei cardiomiociti atriali e la loro risposta a vari agenti farmacologici.
Introduzione
Le cellule staminali pluripotenti sono un potente strumento per la generazione e lo studio delle cellule da una miriade di difficoltà ai tessuti di accesso per ricerche e studi pre-clinici di base, in particolare negli esseri umani 1-5. Una corretta modulazione delle vie di segnalazione di sviluppo in grado di dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti al destino fenotipica desiderata. Molti protocolli sono stati sviluppati per generare cardiomiociti (CMS) a partire da cellule staminali pluripotenti 6-14. Questi protocolli comportano generalmente la modulazione di TFGβ superfamiglia (Activin, BMP e TGFβ) e percorsi attrave....
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Protocollo
1. Preparazione di cellule di coltura, soluzioni e reagenti.
- Preparare 500 ml di mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) mezzi di miscelazione e filtrazione sterile (0,2 micron dimensione dei pori) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml di calore inattivato siero fetale bovino (FBS), 5 ml 100X concentrato L- sostituzione di glutammina, 5 ml ricombinante del mouse leucemia inibitorio Factor (LIF) a 1 x 10 7 unità per ml e 1,43 microlitri ß-mercaptoetanolo (concentrazione finale è di 50 micron). Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare 500 ml di embrioidi corpo (EB) mezzi di differenziazione per m....
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Risultati
Prima di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti dovrebbero essere compatto e privo di differenziazione spontanea. Le cellule mostrati nella Figura 1A sono pronti per essere singolarizzati e utilizzato per appendere gocce come descritto in 5.1 della sezione del protocollo. Le cellule illustrati nella Figura 1B sono spontaneamente la differenziazione e non devono essere utilizzati per la preparazione di gocce sospese.
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Discussione
Questo protocollo produce ordinariamente culture con una elevata percentuale di CMS che sono caratteristici della stirpe atriale. Come con qualsiasi protocollo di differenziazione, la qualità delle mESCs prima di differenziazione dovrebbe essere data particolare attenzione. mESCs dovrebbero essere monitorati di routine per una corretta morfologia (Figura 1A). Qualsiasi differenziazione spontanea che si verifica prima della formazione di EB si limitano fortemente l'efficienza del cardiogenesis e deve.......
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Dichiarazioni
Gli autori di questo manoscritto non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 "Programmi in meccanismi cardiovascolari: Formazione in Investigation" (JB).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoetanolo | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Aminoacidi non essenziali | Sigma | M7145 | |
| Piastre per colture tissutali da 10 cm | Sarstedt | 83.3902 | |
| Piastre di Petri batteriche da 10 cm | VWR | 25384-342 | |
| Piastre di Petri batteriche da 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Piastre per colture tissutali a 6 pozzetti | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 proteina ricombinante | R& Amp; D Systems | 2069-PR-050 | |
| Unità filtranti sterili | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatina (da pelle suina) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0,05% Soluzione di tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Life Technologies | 14200 |
Riferimenti
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from....
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Ristampe e permessi
