Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.
وقد وضعت بروتوكولات لتوليد سكان العضلية من الخلايا الجذعية المحفزة، ولكن هذه تسفر عادة خلايا الظواهر مختلطة. تتطلب الباحثين الراغبين في متابعة الدراسات التي شملت فرعية العضلية محددة نهج التمايز أكثر توجيهات. عن طريق التعامل مع الماوس الجذعية الجنينية (ES) الخلايا مع Grem2، وهو خصم BMP يفرز ما هو ضروري لتشكيل غرفة الأذيني في الجسم الحي، ويمكن إنشاء عدد كبير من خلايا القلب مع النمط الظاهري الأذيني. استخدام المحفزة خط الخلايا الجذعية Myh6-عن dsRed-مجلس التوحيد الوطنى هندسيا يسمح لتحديد واختيار، وتنقية الخلايا العضلية. في هذا البروتوكول يتم إنشاؤها الهيئات مضغي من خلايا Myh6-عن dsRed-مجلس التوحيد الوطنى باستخدام طريقة قطرة شنقا وأبقى في تعليق حتى يوم التمايز 4 (D4). في الخلايا D4 تعامل مع Grem2 ومطلية على لوحات الجيلاتين المغلفة. بين لوحظ D8-D10 المناطق المقاولات الكبيرة في الثقافات والاستمرار في توسيع ومature من خلال D14. الجزيئية، والتحليلات النسيجية وelectrophysiogical تشير الخلايا في الخلايا المعالجة Grem2-يكتسب خصائص تشبه الأذيني تقديم نموذج في المختبر لدراسة البيولوجيا العضلية الأذينية واستجابتها لمختلف وكلاء الدوائية.
الخلايا الجذعية المحفزة هي أداة قوية لتوليد ودراسة الخلايا من مجموعة من الصعب الأنسجة الوصول للبحوث والدراسات ما قبل السريرية الأساسية، لا سيما في البشر 1-5. تعديل السليم لمسارات الإشارات التنموية يمكن توجيه تمايز الخلايا الجذعية المحفزة لمصير المظهرية المطلوب. وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتوليد العضلية (CMS) من الخلايا الجذعية المحفزة 6-14. تتضمن هذه البروتوكولات عموما تعديل من TFGβ الفصيلة (Activin، BMP، وTGFβ) والممرات من خلال إضافة موقوتة من عوامل النمو الخارجية و / أو جزيئات صغيرة 10،12-15 WNT. هذه البروتوكولات غالبا ما تكون فعالة في زيادة نسبة الخلايا التي تصبح مضادة، ولكن تفتقر إلى التحديد، وتوليد يقطنها خليط سكاني من الخلايا التي تمثل الأنساب الأذيني، البطين، والنظام العقدي / التوصيل. من أجل دراسة القلب محدد فرعية لAPPRO التمايز أكثر موجهةمطلوب منظمة العمل ضد الجوع.
Gremlin2 (Grem2، وتسمى أيضا البروتين المتصلة دان وسيربيروس أو PRDC قصيرة) هو خصم BMP يفرز ما هو ضروري للتمايز القلب السليم وتشكيل غرفة الأذيني خلال تطوير القلب في الزرد 16. علاج تمييز الخلايا الجذعية الجنينية مع Grem2 في التمايز يوم 4، بعد ذروة التعبير عن علامات أرومية متوسطة T-براتشيوري وسيربيروس مثل 1، ويزيد من غلة مضادة ويولد مجموعة من الخلايا في الغالب من سلالة الأذيني 14.
يستخدم المؤتلف Grem2 لعلاج الخلايا التفريق ويمكن أن يتم باستخدام تقنيات إنتاج البروتين القياسي 17 أو يمكن شراؤها تجاريا. وهو قابل للذوبان عالية في المحاليل المائية ويمكن أن يضاف خارجيا على الثقافات في نقطة الوقت المطلوب.
يمكن تتبع التمايز باستخدام RT-QPCR لقياس التعبير عن ممثل علاماتمن الأسلاف القلب والأوعية الدموية، الأسلاف القلب، وملتزمة مضادة. ويمكن أيضا أن تستخدم المناعي لتحديد وتصور التوزيع المكاني لأنواع الخلايا في القلب.
يتم تنفيذ التطبيقات التي تتطلب مجموعات نقية بسهولة أكبر من عند استخدام نظام مراسل لتحديد وعزل مضادة. لهذا الغرض، أدخلنا αMHC-DsRedNuc بناء في خط خلية الماوس CGR8 ES 14. خلايا CGR8 تنمو وتبقى المحفزة دون الخلايا المغذية، وتسهيل التوسع والتمايز فحوصات 18. يحتوي على خط خلية ES لعن dsRed البروتين الفلوري تسلسل الترميز مع إشارة توطين النووية تحت القلب محددة ألفا سلسلة الميوسين الثقيلة (ألفا MHC أو Myh6) مروج الجين. باستخدام هذه الخلايا، مضادة يمكن التعرف عليها بسهولة ومعزولة لتقدير، فرز الخلايا، الكهربية، شاشات المخدرات، ودراسة آليات التمايز الأذيني.
هذا البروتوكول تنتج بشكل روتيني الثقافات التي تحتوي على نسبة عالية من مضادة التي هي سمة من سلالة الأذيني. كما هو الحال مع أي بروتوكول التمايز، ينبغي إيلاء جودة mESCs قبل التمايز اهتماما خاصا. mESCs ينبغي رصد روتيني لالتشكل الصحيح (الشكل 1A). فإن أي التمايز عفوية أن …
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL083958 وHL100398 (AKH) و2T32HL007411-33 "برنامج في القلب والأوعية الدموية الآليات: التدريب في التحقيق" (JB).
GMEM | Life Technologies | 11710 | |
FBS | Life Technologies | 10082 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
IMDM | Sigma | I3390 | |
Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
BSA | Sigma | 5470 | |
0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |