الإدارة داخل القصبة الهوائية لل<em> المستدمية النزلية</em> في نماذج الماوس لدراسة التهاب الشعب الهوائية
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
هنا، نحن تصف إجراءات تفصيلية لكفاءة وتسليم مباشرة المستدمية النزلية في المجاري التنفسية السفلى من الفئران. ونحن لشرح إجراءات إعداد ه. النزلية اللقاح، تقطير داخل القصبة الهوائية من H. النزلية في الرئة، وجمع السائل النزلة السنخ غسيل (BALF)، وتحليل الخلايا المناعية في BALF، وعزل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير الجيني المغاير. هذا الإجراء يمكن استخدامها لدراسة استجابة الرئة الالتهابية إلى أي بكتيريا، أو فيروس الفطريات. ويفضل القصبة الهوائية تقطير المباشر في الغالب على إجراءات الأنف أو استنشاق الهباء الجوي لأنها توفر أكثر كفاءة اللقاح البكتيري في الجهاز التنفسي السفلي مع أقل الغموض.
Introduction
التهاب هو الآلية المناعية الأساسية للدفاع ضد العوامل المعدية. وهي تشجع القضاء على مسببات المرض وإصلاح الأنسجة التالفة. كما أنها تسهل عملية الانتعاش إلى حالة صحية طبيعية 1. ومع ذلك، والتهاب dysregulated غالبا ما يؤدي إلى الأمراض الالتهابية المزمنة 2. التهاب الشعب الهوائية هو السبب المبدئي للأمراض الرئوية مختلفة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الربو وتليف رئوي 3.
ويرتبط عدم typeable (unencapsulated) المستدمية النزلية (NTHi) مع الأمراض الالتهابية العلوية والسفلية الرئة المزمنة 4،5. ومن الأنواع السائدة معزولة عن الشعب الهوائية أقل من الأطفال والبالغين الذين يعانون من الانسداد 4،6،7 أمراض الرئة المزمنة. وتتميز الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة NTHi قبل upregulation من السيتوكينات proinflammatory (مثل TNF و IL-1β)، وتوسط ذلك بذ mitogen البروتين كيناز تفعيلها (MAPK) والنووي عامل كيلوبايت (NF كيلوبايت) من خلال مستقبلات تول مثل (TLRs) 8.
نماذج الماوس أدوات مفيدة جدا لتحليل الأمراض الكامنة وراء مرض التهاب الرئة بسبب توافر خطوط الجينات ناقصة مختلفة. وقد استخدمت عدة طرق لتطعيم البكتيريا الحية / الموهن والمنتجات البكتيرية، بما في ذلك تقطير الأنف ورذاذ 9،10 الاستنشاق. هنا، علينا أن نظهر داخل القصبة الهوائية تقطير. على الرغم من أن أقل استخداما، وهذا النهج هو أكثر كفاءة وتكرار للغاية نظرا للتسليم المباشر من اللقاح في الجهاز التنفسي السفلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف الإجراء الفريد والغازية الحد الأدنى لتطعيم الرئتين من الفئران مع العوامل المسببة للأمراض الرئة البكتيري. علينا أن نظهر أن هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لدراسة وظيفة الجينات المختلفة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص في الجينات من مسارات الإشارات التهابا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Riferimenti
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).
