Administración intra-traqueal de<em> Haemophilus influenzae</em> En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
A continuación, describimos un procedimiento detallado de manera eficiente y entregar directamente Haemophilus influenzae en las vías respiratorias inferiores de los ratones. Demostramos el procedimiento para la preparación de H. inóculo influenzae, la instilación intratraqueal de H. influenzae en el pulmón, la recogida de fluido de lavado bronco-alveolar (BALF), el análisis de las células inmunes en el BALF, y el aislamiento de ARN para análisis de expresión génica diferencial. Este procedimiento puede ser usado para estudiar la respuesta inflamatoria pulmonar a cualquier bacteria, virus u hongos. instilación traqueal directa se prefiere sobre todo sobre los procedimientos intranasal o inhalación de aerosol, ya que ofrece más eficiente el inóculo bacteriano en el tracto respiratorio inferior con menos ambigüedad.
Introduction
La inflamación es un mecanismo inmunológico fundamental en la defensa contra agentes infecciosos. Promueve la erradicación de patógenos y la reparación del tejido dañado. También facilita la recuperación a un estado normal y saludable 1. Sin embargo, la inflamación dysregulated a menudo conduce a enfermedades inflamatorias crónicas 2. Inflamación de las vías respiratorias es un disparador inicial para diferentes enfermedades pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma y fibrosis pulmonar 3.
El Haemophilus influenzae no tipificable (no encapsulada) (NTHi) se asocia con enfermedades inflamatorias superior e inferior pulmonares crónicas 4,5. Es la especie dominante aisladas de las vías respiratorias inferiores de los niños y adultos con 4,6,7 enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La respuesta inflamatoria después de la infección NTHi se caracteriza por la regulación positiva de citoquinas proinflamatorias (tales como TNF e IL-1β), y está mediada bY por mitógenos proteína quinasa activada (MAPK) y el factor nuclear-kB (NF-kB) a través de los receptores tipo toll (TLR) 8.
Los modelos de ratón son herramientas muy útiles para el análisis de la patología subyacente de la enfermedad inflamatoria pulmonar debido a la disponibilidad de las diferentes líneas de genes deficientes. Varios métodos han sido utilizados para inocular bacterias vivas / atenuadas y productos bacterianos, incluyendo la instilación intranasal y 9,10 inhalación en forma de aerosol. Aquí, demostramos la instilación intratraqueal. Aunque se utiliza con menos frecuencia, este enfoque es más eficiente y altamente reproducible debido a la entrega directa de inóculo en el tracto respiratorio inferior.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento, se describe un procedimiento único y mínimamente invasivo para inocular los pulmones de ratones con un patógeno pulmonar bacteriana. Se demuestra que este procedimiento puede ser usado para estudiar la función de genes diferentes que utilizan ratones que son deficientes en genes de vías de señalización inflamatorias. Este procedimiento también se puede utilizar para estudiar las respuestas inflamatorias a infecciones pulmonares víricas y fúngicas. Las ventajas de este procedimiento con respe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Riferimenti
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