Intra-tracheale Amministrazione<em> Haemophilus influenzae</em> In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
Qui, descriviamo una procedura dettagliata in modo efficiente e fornire direttamente Haemophilus influenzae attraverso le vie respiratorie inferiori di topi. Dimostriamo la procedura per la preparazione H. influenzae inoculo, instillazione intra-tracheale di H. influenzae nel polmone, raccolta di liquido di lavaggio bronco-alveolare (BAL), l'analisi delle cellule immunitarie nel BAL, e l'isolamento di RNA per differenziale analisi di espressione genica. Questa procedura può essere utilizzata per studiare la risposta infiammatoria polmonare a qualsiasi batteri, virus o funghi. instillazione tracheale diretta è per lo più preferito su procedure intranasale o inalazione di aerosol in quanto fornisce in modo più efficiente l'inoculo batterico nel tratto respiratorio inferiore, con meno ambiguità.
Introduction
L'infiammazione è un meccanismo immunitario fondamentale di difesa contro gli agenti infettivi. Promuove eradicazione e la riparazione dei tessuti danneggiati patogeno. Inoltre facilita il recupero ad un normale stato di salute 1. Tuttavia, l'infiammazione disregolato spesso porta a malattie infiammatorie croniche 2. Infiammazione delle vie aeree è un trigger iniziale per diverse malattie polmonari come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), asma e fibrosi polmonare 3.
L'Haemophilus influenzae non tipizzabile (non incapsulata) (NTHi) è associata a malattie infiammatorie superiori ed inferiori polmonari croniche 4,5. E 'la specie dominante isolati dalle vie aeree inferiori di bambini e adulti con cronica ostruttiva 4,6,7 malattia polmonare. La risposta infiammatoria dopo l'infezione NTHi è caratterizzata dalla sovraregolazione di citochine proinfiammatorie (come TNF e IL-1β), ed è mediata by mitogeno proteina chinasi attivata (MAPK) e fattore nucleare-kB (NF-kB) attraverso i recettori Toll-like (TLR) 8.
Modelli murini sono strumenti molto utili per analizzare la patologia sottostante del polmone malattia infiammatoria a causa della disponibilità di diverse linee gene-carenti. Diversi metodi sono stati utilizzati per inoculare batteri vivi attenuati / e prodotti batterici, tra intranasale instillazione e aerosolized 9,10 inalazione. Qui, dimostriamo intra-tracheale instillazione. Sebbene utilizzato meno frequentemente, questo approccio è più efficace e altamente riproducibili a causa della consegna diretta dell'inoculo al tratto respiratorio inferiore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, si descrive una procedura unica e minimamente invasiva per inoculare i polmoni di topi con un agente patogeno batterico ai polmoni. Abbiamo dimostrato che questa procedura può essere utilizzata per studiare la funzione di geni differenti utilizzando topi che sono carenti di geni di vie di segnalazione infiammatorie. Questa procedura può anche essere usato per studiare le risposte infiammatorie alle infezioni polmonari virali e fungine. I vantaggi di questo procedimento rispetto ad altri metodi come intranasale o …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
Riferimenti
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