Une étape négative de purification chromatographique<em> Helicobacter pylori</em> Activation des neutrophiles protéine surexprimée dans<em> Escherichia coli</em> En mode batch
Summary
Procédé à rendement élevé pour une étape de purification du recombinant négatif Helicobacter pylori protéine d' activation des neutrophiles (HP-NAP) surexprimé dans Escherichia coli en utilisant des résines de diéthylaminoéthyle en mode discontinu est décrit. HP-NAP purifié par cette méthode est bénéfique pour le développement de vaccins, de médicaments ou de diagnostic pour H. pylori -Associated maladies.
Abstract
Helicobacter pylori neutrophiles-activating protein (HP-NAP) est un facteur de virulence majeur de Helicobacter pylori (H. pylori). Elle joue un rôle crucial dans H. pylori gastrique induite par l' inflammation en activant les leucocytes plusieurs innés incluant les neutrophiles, les monocytes et les mastocytes. Les propriétés immunogènes et immunomodulatrices de HP-NAP en font un candidat vaccin potentiel diagnostique et H. pylori et un nouveau candidat médicament pour le traitement du cancer. Afin d'obtenir des quantités importantes de HP-NAP purifié utilisé pour ses applications cliniques, une méthode efficace pour purifier cette protéine avec un rendement élevé et la pureté doit être établie.
Dans ce protocole, nous avons décrit un procédé en une étape négative purification chromatographique de HP-NAP recombinante surexprimée dans Escherichia coli (E. coli) en utilisant diéthylaminoéthyle (DEAE) des résines échangeuses d' ions (par ex., Sephadex®) , ile mode de traitement par lots n. HP-NAP recombinante constitue près de 70% de la protéine totale dans E. coli et est presque entièrement récupérée dans la fraction soluble après lyse cellulaire à un pH de 9,0. Sous la condition optimale à un pH de 8,0, la majorité des HP-NAP est récupéré dans la fraction non liée , tandis que les protéines endogènes de E. coli sont efficacement éliminés par la résine.
Cette méthode de purification par chromatographie négative par lots de mode avec DEAE résines échangeuses d' ions donne de HP-NAP fonctionnel à partir de E. coli sous sa forme native avec un rendement élevé et de pureté. Le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer.
Introduction
Helicobacter pylori (H. pylori) est une cause majeure de la gastrite et de l' ulcère gastro – duodénal. Cette bactérie a également été classé comme cancérogène chez l' homme par le Centre international de recherche sur le cancer, une partie de l'Organisation mondiale de la Santé, en 1994. Il a été estimé que la prévalence de H. infection pylori est de 70% dans les pays en développement et 30-40% dans les pays industrialisés 1. Même si le taux de H. infection pylori diminue dans les pays industrialisés, le taux de H. infection pylori dans les pays en développement est encore élevé 2. Le traitement standard pour l' éradication de H. pylori infection consiste en l'administration d'un inhibiteur de la pompe à protons, IPP et deux antibiotiques, la clarithromycine ou le métronidazole et amoxicilline 3. Toutefois, l'augmentation de la résistance aux antibiotiques chez H. pylori la PI thérapie de l' ulcère exhorte le développement de nouvelles stratégies pour prévenir or guérir l'infection. Développement de la vaccination prophylactique et / ou thérapeutique contre H. pylori pourrait fournir une approche alternative pour contrôler H. infection pylori.
Helicobacter pylori protéine d' activation des neutrophiles (HP-NAP), un facteur de virulence majeur de H pylori, a été identifié dans les extraits d'eau de H. pylori avec la possibilité d'activer les neutrophiles adhérer aux cellules endothéliales et produire des espèces réactives de l' oxygène (ROS) 4. L' infiltration des neutrophiles de la muqueuse gastrique trouvée dans H. pylori patients infectés par gastrite active peuvent provoquer une inflammation et des dommages aux tissus de l'estomac. Ainsi, HP-NAP peut jouer un rôle pathologique par l' activation des neutrophiles pour induire une inflammation de l' estomac, ce qui provoque en outre l' ulcère ou H. pylori -Associated maladies gastriques. Néanmoins, HP-NAP est un candidat potentiel pour des applications cliniques 5,6. En raison de la pro immunogène et immunomodulateurspriétés de HP-NAP, cette protéine pourrait être utilisée pour développer des vaccins, des agents thérapeutiques et des outils de diagnostic. Un essai clinique a été mené à l' aide de HP-NAP recombinante comme l' un des composants d'un vaccin contre la protéine H. pylori. Ce vaccin se compose de HP-NAP recombinant associé à la cytotoxine gène A (CagA), et des protéines Une cytotoxine vacuolisante (VacA) formulé avec de l' hydroxyde d'aluminium et il a en outre été démontrée comme étant sans danger et immunogène chez l'être humain 7. En outre, HP-NAP agit comme un immunomodulateur puissant pour déclencher T auxiliaires de type 1 (Th1) multipolarisé réponses immunitaires pour le traitement du cancer et de 8 à réguler à la baisse des réponses immunitaires médiées par Th2 induites par des réactions allergiques et d' infections parasitaires 9,10. En ce qui concerne le diagnostic recombinant ELISA basé sur HP-NAP a été appliqué pour détecter des anticorps sériques contre la HP-NAP de H. pylori patients infectés par le 11. Une étude a montré que le niveau d'anticorps spécifiques HP-NAP dans le sérum de H. pylori patients infectés par le cancer gastrique était significativement plus élevé que chez les patients souffrant de gastrite chronique 12. Une autre étude a également montré que les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP sont associées à la présence de non-cardia 13 adénocarcinomes gastriques. Ainsi, recombinant ELISA à base de HP-NAP peut être appliqué pour détecter les anticorps sériques dirigés contre HP-NAP pour le pronostic du cancer gastrique chez H. pylori patients infectés par l . Pris ensemble, le HP-NAP purifiée pourrait encore être utilisé pour la prévention, le traitement et le pronostic de H. pylori -Associated maladies, ainsi que la thérapie du cancer.
Parmi les différentes méthodes utilisées pour la purification de recombinant HP-NAP exprimé dans Escherichia coli (E. coli) sous sa forme native rapporté jusqu'à présent, une chromatographie sur gel de filtration deuxième étape de purification impliquant est nécessaire pour obtenir de haute pureté HP-NAP 14-16 . Ici, une méthode utilisant la chromatographie négative mode batch avecdiéthylaminoéthyle (DEAE) résines échangeuses d' ions est décrit pour la purification de HP-NAP surexprimé dans E. coli avec un rendement élevé et une grande pureté. Cette technique de purification a été basée sur la liaison des protéines et / ou des impuretés autres que HP-NAP à la résine cellule hôte. A pH 8,0, presque pas d'autres protéines à l'exception de HP-NAP sont récupérés à partir de la fraction non liée. Cette approche de purification utilisant la chromatographie par échange d'ions DEAE en mode négatif est simple et économiser en permettant la purification de HP-NAP recombinante par Chromatographie en une seule étape par la collecte de la fraction non liée du temps. En plus de HP-NAP, plusieurs autres biomolécules, tels que les virus 17, immunoglobuline G (IgG) 18, l' hémoglobine 19, la protéine phosphatase 20, et le facteur de virulence flagelline 21, ont également été rapportés d'être purifiée par chromatographie échangeuse d' ions en négatif mode. Le mode négatif est préféré pour la chromatographie échangeuse d'ions, si des impuretés sont mineuresles composants présents dans l'échantillon soumis à purifier 22. L'application de la chromatographie négative dans la purification de biomolécules naturelles ou recombinantes a été récemment examiné 23.
Le présent rapport fournit une étape par le protocole d'étape pour l' expression de HP-NAP recombinante dans E. coli, la lyse des cellules et la purification de HP-NAP utilisant une Chromatographie en discontinu en mode négatif par DEAE résines échangeuses d' ions. Si une protéine souhaitée pour la purification est adaptée à la chromatographie d'échange d'ions en mode négatif, le protocole décrit pourrait également être adapté comme point de départ pour le développement d'un procédé de purification.
Protocol
Representative Results
Discussion
La Chromatographie discontinue en mode négatif par DEAE résines échangeuses d' anions présenté ici est approprié pour la purification de HP-NAP recombinante surexprimée dans E. coli. Les valeurs de pH des tampons utilisés dans les étapes de lyse des cellules et la purification sont très critiques pour assurer la solubilité du HP-NAP dans E. Les lysats coli et une séparation efficace de HP-NAP recombinante à partir d' impuretés de cellules hôtes, respectivement. Les cellu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).
Materials
| Material | |||
| pET42a-NAP | N/A | N/A | prepared as described in Supplementary data of Refernce 15 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317 |
| E. coli BL21 (DE3) | Thermo Fisher Scientific Inc | C6000-03 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003 |
| Kanamycin | Amresco | 25389-94-0 | http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | MD Biomedical Inc | 101-367-93-1 | http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name =IPTG%20 |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 10837091001 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW |
| N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) | Sigma-Aldrich | T7254 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW |
| N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK) | Sigma-Aldrich | T4376 | protease inhibitor http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW |
| Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate | Bio‐Rad | 500-0006 | for protein quantitation http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate |
| Protein standard (bovine serum albumin) | Sigma-Aldrich | P5619 | a standard protein for Bio-Rad Protein Assay http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW |
| DEAE–Sephadex A-25 chloride form | Sigma-Aldrich | A25120 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW |
| Spectrum/Por dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132720 | with molecular weight cutoff of 14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720; |
| Acrodisc® units with Mustang® E membrane | Pall | MSTG25E3 | for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992 |
| mouse monoclonal antibody MAb 16F4 | N/A | N/A | raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585 |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg | GE Healthcare Life Sciences | 28989335 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335 |
| PlusOne silver staining kit, protein | GE Healthcare Life Sciences | 17-1150-01 | http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001 |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | 17-1440-02 | for density gradient centrifugation to purify human neutrophils http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002 |
| Flat bottom 96-well white plate | Thermo Fisher Scientific Inc | 236108 | http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html |
| Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | protected from light http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW |
| Expand long template PCR system | Sigma-Aldrich | 11681834001 | source of High Fidelity PCR enzyme mix http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW |
| Dpn I | New England Biolabs | R0176S | https://www.neb.com/products/r0176-dpni |
| Xho I | New England Biolabs | R0146S | https://www.neb.com/products/r0146-xhoi |
| E. coli DH5α | Thermo Fisher Scientific Inc | 18265-017 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017 |
| Name | Company | Product Number | Comments |
| Equipment | |||
| U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer | Hitachi | N/A | out of market and upgraded to a new model http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers |
| EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer | Avestin Inc | C315320 | http://www.avestin.com/English/c3page.html |
| Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge | Hitachi Koki Co | 90106401 | for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 18-1900-26 | for gel filtration chromatography http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026 |
| Aviv model 62ADS CD spectrophotometer | Aviv Biomedical | N/A | out of market and upgraded to a new model http://www.avivbiomedical.com/circular.php |
| LAS-3000 imaging system | Fujifilm | N/A | discontinued and replaced http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810 |
| Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter | Perkin-Elmer | 1420-018 | for chemiluminescence detection http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018 |
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