The epithelial cells of the choroid plexus (CP) form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). An in vitro model of the BCSFB employs human choroid plexus papilloma (HIBCPP) cells. This article describes culturing and basolateral infection of HIBCPP cells using a cell culture filter insert system.
The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The BCSFB functions in separating the cerebrospinal fluid (CSF) from the blood and restricting the molecular exchange to a minimum extent. An in vitro model of the BCSFB is based on cells derived from a human choroid plexus papilloma (HIBCPP). HIBCPP cells display typical barrier functions including formation of tight junctions (TJs), development of a transepithelial electrical resistance (TEER), as well as minor permeabilities for macromolecules. There are several pathogens that can enter the central nervous system (CNS) via the BCSFB and subsequently cause severe disease like meningitis. One of these pathogens is Neisseria meningitidis (N. meningitidis), a human-specific bacterium. Employing the HIBCPP cells in an inverted cell culture filter insert system enables to study interactions of pathogens with cells of the BCSFB from the basolateral cell side, which is relevant in vivo. In this article, we describe seeding and culturing of HIBCPP cells on cell culture inserts. Further, infection of the cells with N. meningitidis along with analysis of invaded and adhered bacteria via double immunofluorescence is demonstrated. As the cells of the CP are also involved in other diseases, including neurodegenerative disorders like Alzheimer`s disease and Multiple Sclerosis, as well as during the brain metastasis of tumor cells, the model system can also be applied in other fields of research. It provides the potential to decipher molecular mechanisms and to identify novel therapeutic targets.
המכשול נוזל המוח והשדרה דם (BCSFB) הוא אחד האתרים שלושה מחסום בין הדם למוח 1. לתאם מורפולוגיים שלו הם תאי אפיתל של המקלעת דמה (CP) 2,3, גידול convolute האנדותל אפיתל, המהווה כלי דם מאוד וממוקם החדרים של המוח. המחסום משמש כדי לייצר את הנוזל השדרתי (CSF) וכן להפריד האחרון מהדם. על מנת להשיג תפקוד מחסום, לתאי האפיתל CP להראות פעילות pinocytotic נמוכה, להביע מובילים ספציפיים, ומחוברים בצפיפות על ידי רשת רציפה של צומת הדוקים (TJS) 2,3.
הפפילומה מקלעת דמה עין אנושית (HIBCPP) תאים, נגזרים הפפילומה מקלעת דמה ממאיר של אישה 4 יפנית, ששמשו לבנייה פונקציונלית במודל חוץ גופייה של BCSFB. תאי HIBCPP להראות כמה מאפיינים של BCSFB פונקציונלי כמו ההיווצרות של TJגדילים, התפתחות של פוטנציאל הממברנה transepithelial גבוהה כי ניתן לקבוע ההתנגדות החשמלית transepithelial (TEER), ו permeabilities מינור מקרומולקולות. יתר על כן, תאי HIBCPP להביע מובילי מאפיין, אשר יכול לשמש כדי לווסת את המיקרו-הסביבה היונית, ולהראות פסגה / 5,6,7 קוטביויות basolateral.
BCSFB הוכח לתפקד כאתר כניסה פתוגנים (חיידקים, וירוסים ופטריות) במערכת העצבים המרכזית (CNS) 8. הפלישה של פתוגנים, לרבות meningitidis Neisseria (meningitidis נ), חיידק גראם שלילי, יכולה לגרום למחלות קשות כמו דלקת קרום המוח. עדות לכך שהוא מתגבר על מחסום ההגנה האפיתל של CP נתמכת על ידי תצפיות histopathological בחולים עם מחלת קרום המוח מציגה כמויות מוגברות של meningococci על כלי הדם לתאי האפיתל CP 9,10. כדי לזכות כניסת ba תאי מארחיםcteria לעתים קרובות לחטוף מנגנוני endocytotic, אשר מתווכים או מופעלים על ידי קולטנים משטח ספציפיים הממוקמים על תאי מארחים. מאז אינטראקציות של פתוגנים עם קולטנים אלה יכולים להיות מינים ספציפיים 11, במודלים של בעלי חיים ניתן להתייעץ רק במידה מוגבלת. השורה תא HIBCPP מספק הזדמנות ללמוד את תהליך הפלישה כמו גם את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בתוך מודל המערכת האנושית. העסקה מוסיפה תרבית תאים מאפשרת לנתח אינטראקציות של פתוגנים עם תאי מארחים משני צדדי תא ברורים. חיידקים רבים, נ כולל meningitidis, כפופים בחריפות את השפעת הכבידה במהלך מבחני זיהום. עבור אינטראקציה אופטימלית של פתוגנים עם תאי HIBCPP במהלך המבחנים, החיידקים בתחילה מתווספים לתוך התא העליון של מערכת כנס מסנן תרבית תאים. כדי לאפשר זיהום מן הפסגה או בצד התא basolateral, בהתאמה, שתי וריאציות של מערכת במבחנה כבר established: במערכת תקן תאי HIBCPP הם זורעים לתוך התא העליון של הכנס המסנן, מחקו את המצב כאשר מיקרואורגניזמים נמצאים על CSF בצד ולקבל במגע עם צד apical של התאים (איור 1 א, ג). לעומת זאת, תוך שימוש בתאי HIBCPP במערכת כנס מסנן תרבית תאים הפוכה משקף את התנאים כאשר חיידקים נכנסו לזרם הדם. מיקרואורגניזמים להפיץ את CP דם המפגש לתאי האפיתל מהצד basolateral (איור 1 ב ', ד'). ראויים לציון, במערכת מודל זה הוכח כי חיידקים לפלוש תאי HIBCPP באופן קוטבי במיוחד מן 5,7 בצד התא basolateral.
בהמשך לזיהום של CP, הפתוגנים פלשו יכולים להיות מוכר על ידי מערכת החיסון המולדת באמצעות קשירה לקולטנים-זיהוי תבניות (PRRs). היטב תיאר חברי PRRs שייכים קולטן דמוי אגרה (TLR) המשפחה. TLRs יכול binד למבנים מאפיינים של מיקרואורגניזמים זיהומיות, אשר דפוסים מולקולריים הפתוגן קשור termed (PAMPs). קשירה של הקולטניים מובילה הפעלה של תא מארח איתות מפלי המפעילות ביטוי של ציטוקינים כמוקינים 12, אשר בתורו לגרות גלגול של תאי מערכת חיסון על פני 13,14 BCSFB. הוכח כי תאי HIBCPP להביע כמה TLRs ברמה mRNA וזיהום כי עם נ meningitidis התוצאה הפרשת ציטוקינים כמה וכמוקינים, כולל CXCL1-3, IL6, IL8 ו TNFα 15,16.
כאן אנו מתארים טיפוח וזיהום של קו תאים אנושיים HIBCPP במערכת להכניס תרבית תאים הפוכה המחקה את BCSFB. מערכת מודל זה מאפשרת ללמוד אינטראקציות של פתוגנים עם צד תא basolateral vivo ב רלוונטי וכן את תגובת התאים הבאה.
לתאי האפיתל של CP מהווים את BCSFB שמפריד בין CSF מן 2,3 דם. לאחרונה הקים את הקו הסלולרי HIBCPP כמודל אנושי מתפקד של BCSFB. התאים להציג פונקציות מחסום חשובות של BCSFB במבחנה, כוללים הפיתוח של פוטנציאל הממברנה גבוה, חדירות נמוכות עבור מקרומולקולות, כמו גם הנוכחות של גדילים ר…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Hartwig Wolburg for performing the electron microscopy.
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
4´,6 diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
12-well plates | Starlab | CC7682-7512 | |
24-well plates | Starlab | CC7682-7524 | |
Anti Neisseria meningitidis α-OMP | This antibody was a gift from Drs. H. Claus and U. Vogel (University of Würzburg, Germany) | ||
Alexa Fluor 488 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21441 | |
Alexa Fluor 594 (chicken anti rabbit) | Invitrogen | A21442 | |
Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
Bovine serum albumine (BSA) | Calbiochem | 12659 | |
Chocolate agar plates | Biomerieux | 43109 | |
Cytochalasin D | Sigma | C8273 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES w/o Phenolred | Gibco | 11039-047 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 10270106 | |
FITC-Inulin | Sigma | F3272 | |
Insulin | Sigma | 19278 | |
MgCl2 | Sigma | 2393 | |
NaHCO3 | Sigma | 55761 | |
PBS + Mg +Ca | Gibco | 14040-174 | |
Penicillin/Streptomycin | MP Biomedicals | 1670049 | |
Polyvitex | Biomerieux | 55651 | |
Proteose peptone | BD | 211684 | |
Serum-free medium | Gibco | 10902-096 | |
Thincert cell culture inserts for 24-well plates, pore size 3 µm | Greiner | 662630 | |
Tissue culture flask 75 cm² red cap sterile | Greiner | 658175 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 with MERSSTX01 electrode | Millipore | MERSSTX00 |