Un Coroide Plesso epiteliali modello cellulare della Barriera Fluid Sangue umano-cerebrospinale per studiare l'infezione batterica dal lato basolaterale

Sommario

Le cellule epiteliali del plesso coroideo (CP) formano la barriera sangue-liquido cerebrospinale (BCSFB). Un modello in vitro del BCSFB impiega cellule di papilloma del plesso coroideo umano (HIBCPP). Questo articolo descrive la coltura e l'infezione basolaterale delle cellule HIBCPP utilizzando un sistema di filtri per colture cellulari.

Abstract

Le cellule epiteliali del plesso coroideo (CP), situate nel sistema ventricolare del cervello, formano la barriera sangue-liquido cerebrospinale (BCSFB). Il BCSFB funziona separando il liquido cerebrospinale (CSF) dal sangue e limitando al minimo lo scambio molecolare. Un modello in vitro del BCSFB si basa su cellule derivate da un papilloma del plesso coroideo umano (HIBCPP). Le cellule HIBCPP mostrano funzioni di barriera tipiche, tra cui la formazione di giunzioni strette (TJ), lo sviluppo di una resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e permeabilità minori per le macromolecole. Esistono diversi agenti patogeni che possono entrare nel sistema nervoso centrale (SNC) attraverso il BCSFB e successivamente causare malattie gravi come la meningite. Uno di questi agenti patogeni è Neisseria meningitidis (N. meningitidis), un batterio specifico per l'uomo. L'impiego delle cellule HIBCPP in un sistema di filtri per colture cellulari invertite consente di studiare le interazioni dei patogeni con le cellule del BCSFB dal lato basolaterale della cellula, il che è rilevante in vivo. In questo articolo, descriviamo la semina e la coltura di cellule HIBCPP su inserti di coltura cellulare. Inoltre, è stata dimostrata l'infezione delle cellule con N. meningitidis insieme all'analisi dei batteri invasi e aderenti tramite doppia immunofluorescenza. Poiché le cellule della CP sono coinvolte anche in altre malattie, tra cui malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e la sclerosi multipla, nonché durante le metastasi cerebrali delle cellule tumorali, il sistema modello può essere applicato anche in altri campi di ricerca. Fornisce il potenziale per decifrare i meccanismi molecolari e identificare nuovi bersagli terapeutici.

Introduzione

La barriera sangue fluido cerebrospinale (BCSFB) è uno dei tre siti barriera tra il sangue e il cervello ^1. La correlazione morfologica sono le cellule epiteliali del plesso coroide (CP) ^2,3, un convoluto endoteliale-epiteliale, che è fortemente vascolarizzato e situato nei ventricoli del cervello. Il CP serve per produrre il liquido cerebrospinale (CSF), nonché a separare quest'ultima dal sangue. Al fine di realizzare la funzione di barriera, le cellule epiteliali CP mostrano una bassa attività pinocitotiche, esprimono trasportatori specifici, e sono densamente collegati da una rete continua di giunzioni strette (TJS) ^2,3.

Protocollo

1. Preparare cultura cellulare di filtro Inserti per celle semina HIBCPP in un sistema invertito modello

1. Pre-caldo DMEM / F12 (Ham) supplementato con 5 mg / ml di insulina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 10% di siero fetale bovino (FCS).
2. Utilizzare pinza sterile per posizionare 0,33 cm² area di crescita inserti del filtro coltura cellulare con una dimensione dei pori di 3 micron a testa in giù in un 12-pozzetti (Figura 1E).
3. Riempire media nel vano inferiore dell'inserto filtro di coltura cellulare (circa 3 ml) e 100 ml sulla parte superiore del dispositivo di filtrazione. Inondare la piast....

Risultati

Qui si descrive la coltura e l'infezione delle cellule HIBCPP in un sistema di coltura cellulare inserto invertita. Questo modello permette di studiare i meccanismi di invasione e le vie di segnalazione molecolari alla base dal lato delle cellule basolaterale, riproducendo una situazione fisiologica di batteri diffusione e che entrano cellule epiteliali attraverso il flusso sanguigno (Figura 1).

Le cellule.......

Discussione

Le cellule epiteliali del CP formano il BCSFB che separa il CSF dal ^2,3 sangue. Recentemente abbiamo stabilito la linea cellulare HIBCPP come un modello umano funzionale del BCSFB. Le cellule mostrano importanti funzioni di barriera della BCSFB in vitro, compreso lo sviluppo di un elevato potenziale di membrana, una bassa permeabilità per le macromolecole, così come la presenza di filamenti continui di TJs ^5. Le proteine ​​TJ contribuiscono ad una polarità apicale / basolaterale delle cell.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200-056
4&acuto;,6 diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Life Technologies	D1306
Piastre a 12 pozzetti	Starlab	CC7682-7512
Piastre a 24 pozzetti	Starlab	CC7682-7524
Anti Neisseria meningitidis α-OMP			Questo anticorpo è stato un dono dei dottori H. Claus e U. Vogel (Università di Wüuml; rzburg, Germania)
Alexa Fluor 488 (pollo anti coniglio)	Invitrogen	A21441
Alexa Fluor 594 (pollo anti coniglio)	Invitrogen	A21442
Alexa Fluor 660 Falloidina	Invitrogen	A22285
Albumina sierica bovina (BSA)	Calbiochem	12659
Piastre agar cioccolato	Biomerieux	43109
Citocalasina D	Sigma	C8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES	Gibco	31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES senza fenolo	Gibco	11039-047
Dimetil solfossido	Sigma	D2650
Siero fetale di vitello (FCS)	Life Technologies	10270106
FITC-Inulina	Sigma	F3272
Insulina	Sigma	19278
MgCl2	Sigma	2393
NaHCO3	Sigma	55761
PBS + Mg + Ca	Gibco	14040-174
Penicillina/Streptomicina	MP Biomedicals	1670049
Polyvitex	Biomerieux	55651
Proteosio peptone	BD	211684
Terreno privo di siero	Gibco	10902-096
Inserti per colture cellulari Thincert per piastre a 24 pozzetti, dimensione dei pori 3 e micro; m	Greiner	662630
Pallone per colture tissutali 75 cm² tappo rosso sterile	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma	T8787
Volt-Ohm Meter Millicell-ERS2 con elettrodo MERSSTX01	Millipore	MERSSTX00