تصميم وتطوير أبتمر الذهب الجسيمات النانوية وبناء اللونية فحوصات للتطبيقات الموجودة على الشبكة العالمية الحقل
Summary
تم فحص تصميم وتطوير أبتمر الذهب فحص جسيمات متناهية الصغر اللونية للكشف عن جزيئات صغيرة للتطبيقات في الميدان. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من صحة تطبيق اللونية جهاز ذكي (التطبيق) وتأسست تخزين طويل الأجل للمقايسة لاستخدامها في هذا المجال.
Abstract
تم فحص تصميم وتطوير جسيمات متناهية الصغر أبتمر الذهب (AuNP) فحص اللونية للكشف عن جزيئات صغيرة للتطبيقات في الميدان. وقد وضعت الهدف انتقائية AuNP المقايسات اللون مقرها في بيئة معملية إثبات صحة مفهوم رقابة. ومع ذلك، لم تمارس هذه المخططات إلى نقطة عدم تحديد الاستخدام العملي إلى ما وراء بيئة معملية. يصف هذا العمل النهج العام لتصميم وتطوير واستكشاف مقايسة أبتمر-AuNP اللونية للالتحاليل جزيء صغير وباستخدام مقايسة للإعدادات في الميدان. في الاختبار هو مفيد لالأبتامرات كثف إيقاف فاعلية السطوح جسيمات متناهية الصغر وتوفر وسيلة للحد والقضاء على ردود فعل إيجابية كاذبة لالتحاليل غير المستهدفة. الانتقال هذا النظام لاستخدامات عملية يتطلب تحديد ليس فقط العمر الافتراضي للفحص أبتمر-AuNP، ولكن وضع أساليب وإجراءات لتوسيع مقدرات التخزين على المدى الطويلities. أيضا، واحدة من الاهتمامات المعترف بها مع قراءات اللونية هو العبء الملقى على عاتق المحللين لتحديد بدقة التغيرات غالبا ما تكون خفية في اللون. للتخفيف من المسؤولية على المحللين في هذا المجال، وقد تم تصميم بروتوكول تحليل اللون لأداء واجبات تحديد اللون من دون الحاجة لأداء هذه المهمة على معدات الصف المختبر. وصفت طريقة لإنشاء واختبار بروتوكول تحليل البيانات. ولكن لفهم والتأثير على تصميم فحوصات أبتمر كثف، والتفاعلات المرتبطة مع أبتمر والهدف، وAuNPs تتطلب مزيدا من الدراسة. المعرفة المكتسبة يمكن أن يؤدي إلى الخياطة الأبتامرات لتحسين الأداء الوظيفي.
Introduction
قياس الألوان هي واحدة من أقدم التقنيات المستخدمة في الكيمياء التحليلية. لهذه التقنية، وهو تقرير نوعي أو كمي لتحليلها وتقديمها بالاستناد على إنتاج مركب اللون 1. عادة، المقايسات اللون استخدام الكواشف التي تشهد تحول لون في وجود الأنواع تحليلها، مما يؤدي إلى تغيير اللون يمكن ملاحظتها أو كشفها في طيف الضوء المرئي. وقد استخدم قياس الألوان في الكشف عن الأهداف التي تتراوح بين الذرات أو الأيونات، والجزيئات الصغيرة إلى جزيئات بيولوجية معقدة مثل الأحماض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA)، والببتيدات والبروتينات 2-4. على مدى العقدين الماضيين، أحدثت ثورة في المواد النانوية في مجال فحوصات الكشف، لا سيما مع فحوصات على أساس اللون 5-6. الجمع بين الخصائص الكيميائية والفيزيائية الفريدة للمواد متناهية الصغر مع وجود عنصر الهدف الاعتراف انتقائي، مثل الأجسام المضادة، الأبتامرات النوكليوتيد أو الأبتامرات الببتيد، أدى إلى انبعاث طن تصميم وتطوير فحوصات الكشف اللونية 7.
المعادن النانوية لها أثبتت تعتمد على حجم الممتلكات تغيير اللون، والتي تم استغلالها في تصميم العديد من المقايسات اللونية. جزيئات الذهب (AuNPs) ذات أهمية خاصة نظرا لالمميز الحمراء إلى اللون الأزرق تحول لون، عندما يتم يسببها الحل فرقت الجسيمات لتجميع 8، وعادة من خلال إضافة دقيقة من الملح. وقد أدى القدرة على التحكم في الانتقال من تشتت (أحمر) إلى (الأزرق) الدول تجميعها لإنشاء أجهزة الاستشعار اللونية لالأيونية، صغير الجزيئي، الببتيد، البروتين، والأهداف الخلوية 2-4،9. العديد من هذه المجسات توظيف الأبتامرات كما عزر الاعتراف الهدف.
الأبتامرات هي DNA أو الحمض النووي الريبي (RNA) جزيئات يختار من بين مجموعة عشوائية من 10 12 -10 15 سلاسل مختلفة 10-11. تحدد عملية الاختيار إعادة الهدفعناصر الإدراك مع الانتماءات الملزمة في النظام nanomolar منخفضة، والتطور المنهجي للبروابط كتبها تخصيب الأسي (سيليكس) هي العملية الأكثر المعروف 12-13. وتشمل مزايا الأبتامرات أساس النوكليوتيد لتطبيقات الاستشعار عن سهولة تركيب وتعديل مادة كيميائية يمكن السيطرة عليها، والاستقرار الكيميائي 14-15.
نهج واحد لخلق مقايسة اللونية يجمع المواد النانوية مع عناصر الاعتراف، ويتألف من الجمع بين هذين النوعين من خلال امتصاص المادي للجزيئات الحمض النووي أبتمر على الأسطح AuNP. من خلال ملزمة المستهدفة أبتمر، وأبتمر يواجه التغيير الهيكلي 16-18 الذي يغير تفاعل أبتمر مع سطح AuNP، الأمر الذي يؤدي إلى الحمراء إلى اللون الأزرق استجابة اللون محرض 19 مع إضافة الملح. هذه الميزة المدهشة من AuNPs توفر آلية استجابة اللونية يمكن ملاحظتها للأجهزة القائمة على أبتمر التي يمكن استخدامها لإزالةتوقيع المقايسات اللونية للالتحاليل المختلفة.
المقايسات اللون تصميم باستخدام غير تساهمية، الأبتامرات الحمض النووي كثف جسديا على الأسطح AuNP لها وصمة كونها ضعيفة منصة استشعار بسبب القضايا مع متانة، والميل للفشل خارج بيئة معملية خاضعة للرقابة، ونقص المعلومات المتاحة للاستخدام في عملي إعدادات. ومع ذلك، كان الفحص اللونية أبتمر-AuNP أساس المصالح نظرا لبساطة التشغيل واستجابة اللون يمكن ملاحظتها. والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول لتصميم وتطوير وتشغيل والحد من سطح المتعلقة استجابة إيجابية كاذبة، والتخزين على المدى الطويل من الحمض النووي AuNP المقايسات اللونية القائمة على استخدام الكوكايين كما الحليلة تمثيلا. وعلاوة على ذلك، اقترحنا هذا كثف أبتمر نهج فحص (الشكل 1) بأنها المفيد بسبب البساطة وسهولة الاستخدام التي أسفرت عن خطوات أقل من النهج التقليدي لهذه أبتمر-AuNP الحمارآيس. لهذا الاختبار، كان أول أضافت أبتمر إلى AuNPs، والتي سمحت كثف إلى السطح لفترة طويلة من الزمن. وكان ميزة إضافية لهذا النهج على الحد من الاستجابة لجزيئات الحليلة غير المستهدفة المرتبطة بتفاعلات سطح AuNP. ومع ذلك، كان انخفاض استجابة إيجابية كاذبة على حساب حساسية الفحص. وبالتالي توازن بين حماية السطح وسهولة الوصول إليها تحليلها ضروري للحفاظ على وظيفة الفحص المناسبة. وعلاوة على ذلك، وجود خلل كبير في تحليل فحوصات اللون بوسائل أخرى غير مع الأجهزة هو أن النتائج غالبا ما تكون غير موضوعية ومفتوحة للتفسير من محلل إلى محلل، لا سيما عند محاولة للتمييز الفروق الدقيقة في اللون. على العكس من ذلك، هناك عدد من القضايا مع جعل مختبر القياس على أساس قابل للاستخدام خارج المعمل، مثل توفر الطاقة، والتطبيق العملي مع قابلية، وما إلى ذلك في هذا العمل، تم وضع بروتوكول تحليل اللون لمورقابلية وللقضاء على بعض من التخمين المرتبطة عادة مع اللون الفحص القائمة على التفسير 20-21 ه. بالمقارنة مع المناهج السابقة، سعت هذه الجهود لدفع هذه المقايسات لحدودها لتطبيقات خارج بيئة معملية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على مدى العقد الماضي، وقد وضعت جسيمات متناهية الصغر أساس المقايسات اللونية للكشف عن الأهداف تشمل الجزيئات الصغيرة، والحمض النووي والبروتينات، والخلايا 2-4. المقايسات التي تستخدم الحمض النووي الأبتامرات مع النانوية قد تكتسب الفائدة. عادة، يتم تنفيذ هذه المقاي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partially funded by the Air Force Office of Scientific Research and the Assistant Secretary of Defense for Research and Engineering (Defense Biometrics and Forensics Office). JES participation was supported by a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratory.
Materials
| Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important and solutions were made fresh every time |
| Sodium Citrate Dihydrate | Sigma | W302600-1KG-K | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and solutions were made fresh every time |
| Synergy | Bio-TEK | HT | Any absorbance spectrometer will work, but a platereader provides multiple sample analysis |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Buffer, 1 M sterilized | Amresco | J848 | Any sterilized brand will work |
| Corning, 250 mL Filter System, 0.22 µm cellulose acetate | Fisher | 430767 | Other membranes have been found to remove the AuNPs |
| UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Any absorbance spectrometer will work |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% any brand will work |
| DNA | IDT | Custom | DNA was purified with a desalting column, higher purification techniques can be used |
| Procaine Hydrochloride | ACROS | AC20731-1000 | 99% stocks of 1 mg/mL in methanol were prepared |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144S-500 | 36.5-38.0% w/w other brands will work |
| Cocaine Hydrochloride | Lipomed | COC-156-HC-1LM | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays |
| Nitric Acid | Fisher | A509-SK212 | 65% w/w other brands will work |
| Sodium Chloride Solution, 5 M bioreagent grade | Sigma | S5150-1L | Sterile solutions made from solid will work |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | D5758-25 mL | ≥97% any brand will work |
| Ecgoninemethylester Hydrochloride | Lipomed | COC-205-HC-1LM | We obtained the EME control from the same manufacturer as the cocaine target |
| Microcentrifuge Tubes, Axygen Scientific, nonsterile, 1.7mL | VWR | 10011-722 | We have found the manufacturer greatly affects AuNP assays, and the tubes were autoclaved in house |
| nuclease free water | |||
| methanol |
Riferimenti
- Housecroft, C., Constable, E. . Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry. , 349-353 (2006).
- Bunka, D., Stockley, P. Aptamers come of age-at last. Nat. Rev. Microbiol. 4 (8), 588-596 (2006).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Medley, C., Smith, J., Tang, Z., Wu, Y., Bamrungsap, S., Tan, W. Gold Nanoparticle-Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells. Anal. Chem. 80 (4), 1067-1072 (2008).
- Giljohann, D., Seferos, D., Daniel, W., Massich, M., Patel, P., Mirkin, C. Gold nanoparticles for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (19), 3280-3294 (2010).
- Iliuk, A., Hu, L., Tao, W. Aptamer in bioanalytical applications. Anal. Chem. 83 (12), 4440-4452 (2011).
- Smith, J., Griffin, D., Leny, J., Hagen, J., Chávez, J., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates coupled to an android-based color analysis application for use in the field. Talanta. 121, 247-255 (2014).
- Alivasatos, A., et al. Organization of nanocrustal molecules using DNA. Nature. 382, 609-611 (1996).
- Wang, L., Liu, X., Song, S., Fan, C. Unmodified gold nanoparticles as a colorimetric probe for potassium DNA aptamers. Chem. Commun. (36), 3780-3782 (2006).
- Liu, J., Lu, Y. Fast colorimetric sensing of adenosine and cocaine based on a general sensor design involving aptamers and nanoparticles. Angew. Chem. 118 (1), 96-100 (2006).
- Pavlov, V., Xiao, Y., Shlyahovsky, B., Willner, I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin. J. Am. Chem. Soc. 126 (38), 11768-11769 (2004).
- Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (15), 2672-2689 (2009).
- Hermann, T., Patel, D. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science. 287 (5454), 820-825 (2000).
- Lee, J., Stovall, G., Ellington, A. Aptamer therapeutics advance. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (3), 282-289 (2006).
- Song, S., Wang, L., Li, J., Zhao, J., Fan, C. Aptamer-based biosensors. TrAC. 27 (2), 108-117 (2008).
- Wei, H., Li, B., Wang, E., Dong, S. Simple and sensitive aptamer-based colorimetric sensing of protein using unmodified gold nanoparticles. Chem. Commun. (36), 3735-3737 (2007).
- Zheng, Y., Wang, Y., Yang, X. Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine using unmodified gold nanoparticles. Sensors and Actuators B. 156 (1), 95-99 (2011).
- Chávez, J., MacCuspie, R., Stone, M., Kelley-Loughnane, N. Colorimetric detection with aptamer-gold nanoparticle conjugates: effect of aptamer length on response. J. Nanopart. Res. 14 (10), 1-11 (2012).
- Neves, M., Reinstein, O., Johnson, P. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochimica. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Li, H., Rothberg, L. Label-Free Colorimetric Detection of Specific Sequences in Genomic DNA Amplified by the Polymerase Chain Reaction. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 10958-10961 (2004).
- Li, H., Rothberg, L. Colorimetric detection of DNA sequences based on electrostatic interactions with unmodified gold nanoparticles. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (39), 14036-14039 (2004).
- Smith, J., Medley, C., Tang, Z., Shangguan, D., Lofton, C., Tan, W. Aptamer-Conjugated Nanoparticle for the Collection and Detection of Multiple Cancer Cells. Anal. Chem. 79 (8), 3075-3082 (2007).
- Martin, J., Chávez, J., Chushak, Y., Chapleau, R., Hagen, J., Kelley-Loughnane, N. Tunable stringency aptamer selection and gold nanoparticle assay for detection of cortisol. Anal. Bioanal. Chem. 406 (19), 4637-4647 (2014).
- Shen, L., Hagen, J., Papautsky, I. Point-of-care colorimetric detection with a smartphone. Lab on a Chip. 12 (21), 4240-4243 (2012).
- Choodum, A., Kanatharana, P., Wongniramaikul, W., NicDaeid, N. Rapid quantitative colourimetric tests for trinitrotoluene (TNT) in soil. Forensic. Sci. Int. 222 (1), 340-345 (2012).
