Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen
Summary
This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.
Abstract
Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.
Introduction
In zenuwletsels, worden de proximale en distale zenuwstompen vaak voorkomen directe aanpassing van de zenuw bundels door de laesie 1-2. Gewoonlijk worden axon stukken uit sterk geordende en uitgelijnd bundels van axonen, die complexe netwerken van connectiviteit vormen. Echter, zenuwregeneratie is een chaotisch proces te wijten aan slecht georganiseerde axon uitlijning 3-4. Derhalve voldoende regenererende axons die de laesie overbruggen genereren, is het noodzakelijk om goed georganiseerd axonale uitlijning induceren. Bovendien, demyelinisatie begeleidt zenuwbeschadigingen als gevolg van de dood van de myelinating cellen op het letsel plaats. Sinds demyelinisatie sterk schaadt de geleidende capaciteit van de overlevende axonen, behandelingen gericht demyelinisatie of het bevorderen van remyelinisatie zijn belangrijk voor functioneel herstel na zenuwletsel 5. Dus het doel van dit protocol is om een technische benadering die deze twee aspecten worden behandeld illustrerenvan zenuwregeneratie.
Oppervlak anisotropie, die wordt gedefinieerd als het verschil, gemeten langs verschillende assen in een materiaal fysische of mechanische eigenschappen, is toegepast op celuitlijning, groei en migratie 6-7 beïnvloeden. Naast topografie, zijn er andere methoden om anisotropie induceren. Eerder onderzochten we oppervlak anisotropie geïnduceerd door statische mechanische voorrek poly-dimethyl-siloxaan (PDMS) membraan. De theorie van "kleine deformatie super opgelegd grote" voorspelde dat de effectieve stijfheid van de cellen zin in de gerekte richting afwijkt van de loodrechte richting, en dit verschil in effectieve stijfheid door anisotropie 8 oppervlak. Mesenchymale stamcellen (MSCs) gekweekt op een voorgerekt PDMS membraan kunnen de anisotropie zin door het oppervlak actief trekken en daardoor uitlijnen in de voorgerekte richting 9. Ook een anisotrope oppervlak arising Uit mechanisch voorgerekt oppervlak beïnvloedt de uitlijning, alsmede groei en myelinisatie van dorsale wortel ganglion (DRG) axonen 10. Hier hebben we een protocol voor het induceren oppervlak anisotropie op een statische voorgerekt PDMS substraat axon regeneratie 10 te verbeteren.
Om axon uitlijning, topologische kenmerken met de gewenste patronen te lokken, naar verluidt contact begeleiding bieden door middel van uitgelijnde vezels en kanalen 6,11-12 werd aangetoond dat axon uitlijning 11,13 vergemakkelijken. Meldde echter technieken voor het induceren axon uitlijning met topologische kenmerken, zoals vezels, zenders en patroonvorming, konden verlengen en verhoging van de dikte van de axonen. Daarentegen geleidelijke mechanisch rekken tot axon aanpassing in de verstrekrichting met langere en dikkere axonen die toe met de grootte van het rek 14. Echter, voorzien van een motor aangedreven apparaat in vivo is niethaalbaar. Daarentegen statische voorgerekte geïnduceerde anisotropie eenvoudiger en gemakkelijker kunnen worden opgenomen in toekomstige ontwerpen scaffold voor in vivo toepassingen.
In dit protocol wordt een statische voorgerekt celcultuur gebruikt oppervlak anisotropie induceren zonder topologische kenmerken. De voor uitgerekte kweeksysteem bestaat uit een PDMS membraan, een rekbaar frame en een stretching fase, waarna het membraan op het frame is bevestigd en een vooraf bepaalde magnitude rek wordt aangebracht op het podium strekken. Vers geïsoleerde DRG neuronen gekweekt op het voorgerekte oppervlak maximaal 21 dagen gecontroleerd op axon uitlijning en dikte. Vervolgens Schwann-cellen (SC) tezamen gekweekt met de uitgelijnde axonen gecontroleerd op myelinisatie. Door de integratie voorreksysteem oppervlak geïnduceerde anisotropie konden we celuitlijning-differentiatie en axon-groei uitlijning van MSC's en DRG neuronen 9-10 respectievelijk verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om axon aanpassing aan voorgerekt oppervlak induceren, zijn er twee belangrijke stappen: 1) het PDMS membraan moet vlak en vormt een homogene dikte; en 2) gliacellen moeten van de DRG verwijderd. Na mengen van de PDMS en crosslinker en uitharding in een oven, moet de verknoopte PDMS gel op een vlakke werktafel bewaard en voorzichtig behandeld om eventuele kantelen te vermijden. De zuurstof plasmabehandeling van het PDMS membraan worden gevolgd door 6 uur PLL-bekleding, aangezien de hydrofiliciteit van het oppervlak (ver…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Eric Vasco bedanken voor zijn hulp bij de voorbereiding van het PDMS substraten, Dr. Shiyong Wang in het lab van Dr. Marina Mata aan de Universiteit van Michigan voor nuttige tips en training van de DRG isolatie, en Dr. Mark Tuszynski en Dr. . W. Marie Campana bij UC San Diego voor nuttige tips en protocol voor de SC isolement. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de National Science Foundation (CBET 0.941.055 en CBET 1.510.895), het National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 en R01EB014986).
Materials
| Polydimethylsiloxane （PDMS) | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| Neurobasal Medium 1X | GibcoBRL | 21103-049 | |
| B27 Supplement 50X | GibcoBRL | 17504-044 | |
| Glutamax-I 100X | GibcoBRL | 35050-061 | |
| Albumax-I | GibcoBRL | 11020-021 | |
| Nerve Growth Factor-7S | Invitrogen | 13290-010 | |
| Penicillin-streptomycin | GibcoBRL | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA/1mM EDTA | GibcoBRL | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysine | Trevigen | 3438-100-01 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | p-6407 | |
| Fluoro-2 deoxy-uridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | Isolation Buffer |
| Type I Collagenase | Worthington | LS004196 | |
| DMEM | Gibco | 11885 | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30080.03 | |
| BPE | Clonetics | CC-4009 | |
| Forskolin | Calbiochem | 344270 | |
| Silicone chamber | Greiner bio-one | FlexiPERM ConA | |
| Plasma cleaning/etching system | March Instruments | PX-250 | |
| Anti-Thy 1.1 antibody | Sigma- Aldrich | M7898 | |
| Rabbit Complement | Sigma- Aldrich | S-7764 | |
| Standard growth medium | For 500 ml Neurobasal Medium 1X, add 10 ml of B-27 50X, 5 ml of Glutamax-I 100X, | ||
| 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF– 7S (50 ug/ml). | |||
| FDU and Uridine stock solution | FDU 100mg in 10ml of ddw (10mg/ml), filter in the hood and divided in 500ul aliquots and store at -20 ºC. | ||
| Uridine 5g in 166.7ml of ddw (33mg/ml), filter in hood, divide in 200ul aliquots and store at -20 ºC. | |||
| Take 61.5ul of FDU (10mg/ml) and 20.5ul of Uridine(33mg/ml), and add 4918ul of ddw to a final stock concentration, | |||
| then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC. |
Riferimenti
- Liu, C., et al. . Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications. , 525-546 (2015).
- Faweett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral Nerve Regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
- Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 277, 2000-2002 (1997).
- Geller, H. M., Fawcett, J. W. Building a bridge: Engineering spinal cord repair. Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).
- Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination. J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).
- Chua, J. S., et al. Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance. Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).
- Dowell-Mesfin, N. M., et al. Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons. J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).
- Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries. Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).
- Liu, C., et al. Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells. Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).
- Liu, C., et al. The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Berns, E. J., et al. Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels. Biomaterials. 35, 185-195 (2014).
- Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons. Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).
- Xia, H., et al. Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers. Brain Research. 1565, 18-27 (2014).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration. Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).
- Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).
- Lopera, S., Mansano, R. D. Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding. ISRN Polymer Science. 2012, (2012).
- Chandra, G. . Organosilicon Materials. , (2013).
- Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).
- Moore, M. J., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27, 419-429 (2006).
- Clarke, J. C., et al. Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth. Hearing Res. 278, 96-105 (2011).
- Pfister, B. J., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
